Fattori estrinseci che influenzano lo sviluppo dei microrganismi negli alimenti e le relative strategie di sopravvivenza Dott.ssa Calzone Antonella Dott.ssa Manzini Francesca Dott. Massai Tommaso Dott.ssa Rapezzi Sara

I parametri ambientali chimico-fisici sono in grado di inibire o promuovere lo sviluppo e la crescita dei microrganismi Fattori intrinseci relativi all’ ambiente interno all’ alimento Presenza/assenza di nutrienti pH Potenziale redox aw Fattori estrinseci relativi all ’ambiente esterno all’ alimento Temperatura Umidità relativa Composizione dell’Atmosfera

può portare a differenti risultati: produzione di proteine che vanno a riparare il danno, al mantenimento della stabilità cellulare o all'eliminazione dell'agente stressogeno; incremento transitorio della tolleranza o della resistenza verso i fattori deleteri; ingresso del microrganismo in uno stato di quiescenza (formazione di spore) o al passaggio ad uno stato di VBNC (vitale ma non coltivabile); mutazioni genetiche adattative il meccanismo con cui questo risponde ad un determinato stress, può portare ad uno stato di tolleranza ogni fattore deleterio, ogni condizione che influenza negativamente la crescita o la sopravvivenza microbica Nel caso in cui un microrganismo non è in grado di rispondere ad uno stress o le sue risposte non risultano efficaci, si verifica un danno a livello delle componenti cellulari il danno può essere talmente deleterio per il microrganismo da portare alla morte cellulare

La temperatura è un parametro che influenza la crescita microbica. Ciascun microrganismo presenta un proprio optimum termico di crescita ed un proprio range di temperature all'interno del quale è in grado di moltiplicarsi. L'effetto di uno stress termico su un microrganismo risulta molto differente se la temperatura ambientale è maggiore o minore rispetto al range di crescita.

ALTE TEMPERATURE Temperature superiori ai 65°C non solo inibiscono i normali processi cellulari, ma possono portare anche alla morte del microrganismo Gli effetti dannosi indotti dalle alte temperature coinvolgono: la denaturazione delle proteine con l'immediata successiva aggregazione la fluidità delle membrane la stabilità di macromolecole quali acidi nucleici e ribosomi. Il microrganismo risponde attraverso l'aumento della sintesi di un gruppo di proteine da shock termico in grado di promuovere: il corretto ripiegamento dei polipeptidi l'assemblaggio dei complessi proteici la degradazione e la traslocazione delle proteine. I microrganismi rispondono agli stress termici in modo molto differente, soprattutto strettamente legato alla loro capacità di entrare o meno in uno stato sporigeno di completa resistenza

RISPOSTA A LIVELLO DI FLUIDITA’ DI MEMBRANA Il trattamento termico provoca un danno a livello della membrana cellulare I trattamenti termici lievi possono portare ad un adattamento della membrana cellulare aumentando la saturazione e la lunghezza degli acidi grassi, al fine di mantenere ottimale la fluidità e l'attività delle proteine intrinseche La principale conseguenza dei lieviti dovuta alle alte temperature è la morte cellulare; nel caso in cui le cellule riescano a sopravvivere si verifica un incremento della fluidità e una riduzione della permeabilità di nutrienti essenziali Una protezione efficace contro il calore può anche essere raggiunta con l'accumulo di osmoliti che hanno il compito di migliorare la stabilità proteica e di proteggere gli enzimi Alcuni microrganismi, come per esempio quelli appartenenti ai generi Bacillus e Clostridium, sono in grado di resistere all'esposizione al calore grazie alla loro capacità di produrre spore

RISPOSTA A LIVELLO DI ESPRESSIONE GENICA: “HEAT SHOCK RESPONSE” Heat shock proteins (Hsps) Gruppo di proteine sintetizzate dalle cellule batteriche a seguito dell’esposizione ad alte temperature Assistono le proteine di nuova sintesi nel raggiungimento della giusta conformazione e promuovono la degradazione delle proteine danneggiate Alcune Hsps sono sintetizzate a livelli bassi anche in condizioni di non-stress Il processo di adattamento ed inizialmente di difesa contro le alte temperature è chiaramente un importante obiettivo durante la conservazione degli alimenti e l'impiego di ostacoli tecnologici

BASSE TEMPERATURE La maggior parte dei microrganismi cresce in un range di temperatura compreso fra i 5°C e i 65°C. Valori di temperatura inferiori al range di crescita non sono in grado di uccidere il microrganismo, ma solamente di rallentarne od inibirne il suo naturale sviluppo. La sensibilità di una cellula microbica dipende da diversi fattori: temperatura stessa, tasso di congelamento/raffreddamento, terreno di coltura, ceppo microbico durata dell'esposizione. Questo tipo di shock termico può portare a vari tipi di cambiamenti fisiologici, morfologici e metabolici della cellula

RISPOSTA A LIVELLO DI ATTIVITA' ENZIMATICA E METABOLICA Le basse temperature portano la cellula microbica ad una riduzione sostanziale della propria attività enzimatica Ritardi dell'attività enzimatica portano a cambiamenti nella produzione di metaboliti che possono portare alla cessazione della crescita microbica. I microrganismi psicrofili sono in grado di: sintetizzare elevate quantità di enzimi per compensare la riduzione dell'attività metabolica produrre enzimi attivi al freddo (cold-adapted) in modo da prevenire il deterioramento B C

RISPOSTA A LIVELLO DI FLUIDITA’ DI MEMBRANA Le basse temperature portano i componenti fluidi della cellula ad uno stato gelatinoso che impedisce il corretto funzionamento proteico I microrganismi sono però in grado di modificare la propria componente lipidica, in particolare incrementando la proporzione di acidi grassi insaturi e a catena corta che permettono di mantenere la fluidità di membrana

RISPOSTA A LIVELLO DI ESPRESSIONE GENICA: “COLD SHOCK RESPONSE” Lo shock da basse temperature può causare una stabilizzazione dei legami idrogeno della struttura secondaria degli acidi nucleici che comporta una riduzione nell'efficienza di trascrizione, traduzione e replicazione del DNA “Cold Shock Response” risposta del microrganismo alle basse temperature, che coinvolge i processi di regolazione dell'espressione genica Produzione di “Cold Induced Proteins” (CIPs): mantenimento della fluidità di membrana, incrementando la proporzione di acidi grassi corti e insaturi. incremento del super-avvolgimento del DNA. promozione delle trascrizioni e delle traduzioni dei geni necessari all'adattamento alle basse temperature. Le CIPs si dividono in due principali famiglie: CAPs , responsabili della risposta immediata. CSPs , che agiscono come chaperoni degli acidi nucleici.

UMIDITA’ RELATIVA a w = UR/100 parametro atmosferico, misura dell’ attività dell’acqua in fase gassosa L’umidità relativa dell’ambiente di conservazione è un fattore relativamente poco importante, se non per le sue relazioni con la conservazione e l’aw degli alimenti a w = UR/100 L’umidità dell’ambiente di conservazione di un alimento influenza lo sviluppo microbico: influenza l’attività dell’acqua dell’alimento favorisce lo sviluppo superficiale dei microrganismi CONSERVAZIONE Ridotta UR per alimenti con bassa attività dell’acqua (aw< 0,60) poiché tendono ad assorbire acqua fino al raggiungimento dell’equilibrio Elevata UR favorisce invece la crescita superficiale di lieviti, muffe e microrganismi aerobi

COMPOSIZIONE DELL’ATMOSFERA I gas principali che compongono l’atmosfera (N₂ 78%; O₂ 21%; Ar 0,9%, CO₂ 0,4%) solo O₂ e CO₂ hanno un effetto diretto sui microrganismi Concentrazioni di O₂ pari o superiori a quella atmosferica hanno un effetto inibitorio verso i microrganismi anaerobi stretti e microaerofili Viceversa la sostituzione dell’O₂ con gas inerti inibisce i microrganismi aerobi stretti La CO₂ è sicuramente il gas che ha l’effetto maggiore sui microrganismi aerobi (batteri aerobi Gram⁻ sono più sensibili delle muffe e dei batteri aerobi Gram⁺) Leggero effetto inibitorio su alcuni microrganismi anaerobi facoltativi e anaerobi stretti, ma la maggior parte sono resistenti. La CO₂ produce effetti inibitori, a partire da una concentrazione del 20%, che dipendono da diversi fattori: è molto solubile e può penetrare attraverso le membrane cellulari, diminuendo il pH intracellulare altera le proprietà fisiche della membrana citoplasmatica e il meccanismo di trasporto dei soluti elevate concentrazioni di CO₂ hanno un effetto diretto sulle reazioni di decarbossilazione

Listeria monocytogenes Clostridium botulinum Yersinia enterocolitica La CO₂ grazie alla sua azione batteriostatica e fungistatica può essere impiegata nella conservazione in atmosfera modificata, per prolungare la shelf – life degli alimenti (prolungamento della fase Lag, rallentamento della crescita in fase esponenziale) Sui microrganismi anaerobi facoltativi e anaerobi stretti le atmosfere protettive non hanno in genere un effetto inibitorio significativo Listeria monocytogenes Clostridium botulinum Yersinia enterocolitica Staphilococcus aureus Crescono in alimenti conservati in atmosfere protettive raggiungendo livelli pericolosi E’ opportuno, quindi, che il processo per la produzione degli alimenti destinati ad avere una shelf - life maggiore includa ulteriori barriere: trattamenti di pastorizzazione trattamenti fisici abbassamento di pH e dell’ aw aggiunta di conservanti

MICRORGANISMI E ALIMENTI Da alcuni studi sono stati evidenziati aspetti positivi dovuti all'adattamento dei batteri presenti negli alimenti, nei confronti di fenomeni stressogeni

YOGURT Bifidobacterium e Lactobacillus acidophilus La vitalità di questi batteri può decrescere rapidamente soprattutto durante la fase di stoccaggio a causa dell'acidità degli stessi alimenti. Viene quindi applicata una tecnica di pre-adattamento al fine di migliorare la sopravvivenza dei batteri probiotici agli stress acidi. Le colture starter impiegate nel processo di fermentazione sono in grado di sopportare stress da surgelazione e congelamento. Alcuni studi hanno dimostrato inoltre che il trattamento mediante shock termico, applicato con basse temperature e precedentemente alla fase di congelamento vera e propria, è in grado di migliorare drasticamente la criotolleranza di tali colture starter.

La produzione di vino prevede l'uso di basse temperature, intorno ai 10-15°C in modo da trattenere i composti volatili responsabili dell'aroma. I lieviti, durante il processo di fermentazione, vanno incontro a diversi tipi di stress: alte concentrazioni zuccherine nel mosto aumento della pressione osmotica. accumulo di etanolo presenza di solfiti Ciò che caratterizza i lieviti tolleranti agli stress è la regolazione dei geni responsabili alla resistenza Vengono utilizzate tecniche di pre-adattamento per permettere al microrganismo di compiere i processi in modo efficente anche a temperature sub-ottimali

VINO Saccharomyces cerevisiae Le basse temperature hanno molti effetti sulle proprietà biochimiche e fisiologiche sulle cellule di lievito. Per questo motivo sono stati svolti numerosi test per chiarire la risposta al freddo di S.cerevisiae attraverso metodologie High-throughput. Questi studi hanno analizzato le risposte trascrizionali del genoma di S.cerevisiae con l'esposizione a basse temperature. I risultati relativi alla Cold Shock Response hanno evidenziato due diverse fasi di risposta: ECR (Early Cold Response) Risposta precoce che si manifesta nelle prime 12 ore dall'esposizione Coinvolgimento dei geni implicati nel metabolismo di RNA e lipidi LCR (Late Cold Response) Risposta tardiva che si manifesta in seguito alle prime 12 ore dall'esposizione Coinvolgimento dei geni codificanti diverse proteine con funzione protettiva per la cellula

PRODOTTI DA FORNO In panetteria la temperatura di lievitazione è un parametro importante che regola la crescita dei Lactobacilli e dei lieviti. Candida milleri Lievito endogeno principale responsabile dei processi fermentativi. In condizioni sperimentali, tale microrganismo sembra essere in assoluto uno dei più attivi. Le basse temperature di fermentazione sono in grado di rallentare lo stato di acidificazione, favorendo un aumento della produzione di CO2 da parte del microrganismo. Gli effetti delle basse temperature sono stati analizzati anche sulla fisiologia dei lieviti: le risposte trascrizionali presenti durante l'adattamento a temperature al di fuori del range ottimale (10°C-20°C), in cui il lievito riusciva a crescere, erano diverse da quelle riscontrate a temperature al di sotto dei 10°C dove la crescita cessava.

Grazie per l'attenzione