L’ospite indesiderato La tubercolosi, malattia globale. Nuovi farmaci e implicazioni socio-sanitarie Ottaviano Serlupi Crescenzi, Research Scientist Oggi parliamo di tubercolosi: una delle grandi malattie globali, e dimenticate. -Malattie spesso curabili, ma diffuse in tutto il mondo, in particolare nel sud del mondo, dove le grandi aziende non hanno mai investito in quanto le risorse dei governi e dei pazienti sono scarse e non c’è mai stato ritorno dell’investimento -Queste malattie hanno un impatto sanitario imponente

L’ospite indesiderato? Il micobatterio della tubercolosi E’ un batterio che si insinua all’interno delle cellule infettate Una volta penetrato nell’organismo dell’ospite, persiste per anni, a volte tutta la vita Le cure antibiotiche non durano giorni o settimane, ma mesi o anni Ma: LA TUBERCOLOSI SI PUO’ CURARE Chi è l’ospite indesiderato? E’ il mycobatterio tub. Dalle vie aeree entra all’interno delle cellule infettate e permane stabilmente nell’organismo ospitante, anche tutta la vita Micobatteri della tubercolosi (in rosso) adesi ad un macrofago (in azzurro), cellula del sistema immunitario dell’ospite

Tubercolosi - Le forme del contagio I Il contagio avviene in genere tramite le vie respiratorie Il micobatterio della tubercolosi, una volta penetrato nel polmone, viene fagocitato dai macrofagi Nei macrofagi, i micobatteri sono intrappolati in strutture vescicolari dette endosomi Gli endosomi si fondono nei lisosomi e distruggono il micobatterio Alcuni micobatteri riescono a sopravvivere ed a persistere nel macrofago bloccando la maturazione dell’endosoma (Descrizione slide) Eventi che seguono l’ingresso di micobatteri della tubercolosi in un macrofago. Da: SHE Kaufmann, Ann Rheum Dis 2004;63;50-56

Tubercolosi - Le forme del contagio II I macrofagi infettati lanciano segnali ad altre cellule del sistema immunitario Diverse cellule del sistema immunitario accorrono al sito di infezione Si forma una struttura solida, il granuloma, che ingloba le cellule del sistema immunitario, i macrofagi uccisi dai micobatteri, i micobatteri uccisi dai macrofagi ed i micobatteri sopravvissuti Il granuloma può contenere l’infezione per anni, anche per tutta la vita (Descrizione slide) Il ruolo delle citochine nella formazione di un granuloma, una struttura di contenimento dell’infezione da tubercolosi

Dall’infezione con M. tb alla tubercolosi attiva (Descrizione slide) tuberculin skin test IFNgamma release assay Pai, M. et al. (2016) Tuberculosis Nat. Rev. Dis. Primers doi:10.1038/nrdp.2016.76

Le nostre difese sono efficaci Al mondo, un individuo su tre, nel corso della propria vita è entrato in contatto con il micobatterio tubercolare: più di 2 miliardi di persone Tuttavia, si stima che solo 200 milioni di questi individui in tutto il mondo, nel corso della propria vita, sviluppano la tubercolosi Quindi: 1 miliardo e 800 milioni di individui al mondo, pur essendo entrati in contatto con il micobatterio nel corso della propria vita, non svilupperanno mai la tubercolosi (Descrizione slide) Questi numeri mostrano che la TB è una malattia globale

La tubercolosi si può vincere I diagnostici più in uso sono vecchi di 100 anni (nuovi diagnostici ora disponibili devono raggiungere efficacemente i Paesi più colpiti) I vaccini più in uso sono vecchi di 80 anni Gli antibiotici più in uso sono vecchi di 40 anni. Ma molti nuovi antibiotici sono in sviluppo, anche per MDR-TB La ricerca sulla TB deve crescere: è necessario trovare sempre nuove risorse finanziarie e umane. La TB si può vincere: oggi si stima che il 95% dei casi è guaribile Delamanid (2014) Bedaquiline (2012) Le nostre difese possono essere aiutate da antibiotici, che hanno salvato milioni di persone. Ma i più importanti sono vecchi di 40 anni. E’ difficile fare ricerca sulla TB, è una malattia negletta come illustrato prima, pochi investimenti tradizionali. Eppure i frutti della ricerca, un nuovo farmaco, un nuovo diagnostico, possono avere un grande impatto positivo. Negli ultimi anni tuttavia, qualcosa si è mosso: bedaquilina, delamanid I farmaci di prima linea contro la TB

Screening per isolare hits attivi contro M Screening per isolare hits attivi contro M. tuberculosis: bedaquilina (TMC207) Bedaquilina (TMC207): Screening: 70mila molecole, selezionando prototipi di differenti serie chimiche (diarilchinoline) Readout: sopravvivenza di cellule intere vitali dopo cicli multipli di crescita Ceppo: M. smegmatis Whole cell survival Whole cells or isolated inverted membrane vescicles Un nuovo farmaco è un impegno gigantesco. Avete visto la bedaquilina approvata alla fine del 2012: il primo paper, già su risultati promettenti, è del 2005 su Science. Schema assay HTS: partendo da zero, screening su cellule vive, ed il readout è la SRV: poca specificità Se il target è noto e validato dal punto di vista clinico, (illustrare strategia) ..... Per bedaquilina 70mila (illustrare box) .....

Bedaquilina: mutazioni di resistenza identificano il target molecolare: ATPsintetasi Allineamenti delle sequenze di atpE (subunità multimerica c) di M.tuberculosis (a sinistra) e di M.smegmatis (a destra). Le sequenze in alto sono isolate dai ceppi sensibili, quelle in basso dai ceppi resistenti. Le frecce indicano le uniche comuni mutazioni associate alla resistenza. In nero le sequenze più conservate, in viola le intermedie (K. Andries et al. Science, 2005. 307, 223-227). -I ricercatori francesi americani e svedesi hanno selezionato ceppi resistenti sia in M.smegmatis che in Mtb, hanno sequenziato il genoma di ceppi resistenti e sensibili (WGS) -Solo mutazioni in atpE associate alla resistenza per tutti e due i ceppi, confermati con trasformazione: ATP sintetasi, --Enzima di membrana disegnato a sinistra. Modello al centro: sotto Fo 2a, 2b, 9-15c - sopra F1 3α, 3,  -Lavori successivi hanno portato a un modello di interazione tra subunità c ed  dell’enzima e bedaquilina. Modello molecolare della ATP sintetasi di M.tuberculosis. Nel riquadro a destra, la subunità inibitoria  (azzurro) della componente F0 è mostrata insieme alla subunità multimerica c (beige). La molecola TMC207 è mostrata in verde (G. Blukovic et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013. 57, 168–176).

Benzotiazinoni (PBTZ169): identificazione di DprE1 come target molecolare in Mtb. Tutti i mutanti Mtb resistenti a BTZ043 hanno una mutazione in C387 di DprE1, enzima che converte un ribosio in arabinosio, nella biosintesi della parete cellulare. C387 è altamente conservato in diversi ortoghi, eccetto che in ceppi resistenti a BTZ043. In basso a destra, il modello di interazione tra PBTZ169 (in verde) e DprE1 (grigio) con il cofattore FAD (giallo) PBTZ169 è sviluppato oggi da iM4TB, partner di StopTB Partnership. Conclusione Fase I prevista: Novembre 2016 V. Makarov et al. Science, 2009. 324, 801 BTZ043 PBTZ169 Lipofilicità aumentata Un altro esempio di sviluppo di una molecola non ancora entrata in clinica: -Anche qui screening per classi di composti (eterociclici contenenti zolfo) con readout vitalità M.smegmatis e M.vaccae. –Isolato un benzotiazinone, BTZ043  Un caso in cui efficacia su target non corrisponde ad efficacia in vivo -Testati molti sostituti, ma solo in posizione 2: solo lipofilici mantenevano attività, ottimale un anello benzotiazinonico. -In sostanza screening più mirato con disegno razionale e Struc-Act-Rel -Ricerca di mutanti M.tb resistenti: tutti con C387 mutata in dprE1: sintesi arabinosi, parete. In ortologhi C387 molo conservata, non conservata in ceppi naturalmente resistenti -Modello basato sull’ottenuta cristallizzazione dell’addotto: interazione covalente come BTZ043 V. Makarov et al. EMBO MM, 2014. 6, 372

https://youtu.be/pRiKWg_xOMs

TB: una malattia della povertà Oggi, i Paesi a più alta incidenza di tubercolosi non sono diversi da come era l’Europa ai primi dell'ottocento Ai primi dell’ottocento in Europa la tubercolosi rappresentava il 25% tra tutte le cause di morte Il declino della mortalità in Europa è cominciato verso la metà dell’800, con il miglioramento delle condizioni di vita, ancora prima dell’avvento degli antibiotici La tubercolosi è una malattia della povertà, dell’indigenza, delle precarie condizioni sanitarie e igieniche Successo si misura con migliore diagnosi e cura e con migliori condizioni igieniche e sanitarie Oggi per noi è facile dimenticare la TB, non ci tocca da vicino. Ma i numeri che abbiamo visto, soprattutto nell’Africa subsahariana, sono gli stessi presenti in Europa ai primi dell’800: la TB dominava l’immaginario collettivo: La TB era causa del 25% della mortalità totale, una persona su 4 moriva di TB....

TB: una malattia dimenticata Nei mass-media si parla poco di tubercolosi. «si muore di TB come se 14/15 Boeing 767 a pieno carico cadessero tutti i santi giorni... Ma di TB non se ne parla» da una lettera di Stop TB Italia Il 24 marzo è tradizionalmente la giornata mondiale per la lotta alla tubercolosi: un’occasione per parlare di una malattia dimenticata La sera del 24 marzo 1882, in una brillante conferenza a Berlino, Robert Koch dimostra che la tubercolosi è causata da un batterio, il Mycobacterium tuberculosis … (Descrizione slide)…

TB: una malattia globale 10,4 milioni di nuovi casi ogni anno nel 2015. Solo 6,1 milioni riportati Nel mondo, 1,8 milioni di morti nel 2015 (inclusi 0,4 milioni HIV-positivi) Le regioni più colpite sono in Africa e in Asia In Africa, 275 nuovi casi ogni 100.000 abitanti Al mondo, 142 nuovi casi ogni 100.000 abitanti -Ma vediamo ora i numeri di questa malattia globale, dati Report OMS 2016 -Situazione peggiore di quanto riportato da OMS anno passato: paradossalmente causata da monitoraggio migliorato nel 2015, soprattutto in India - ……… (Descrizione slide). OMS Global TB Report 2016

La multiresistenza agli antibiotici: MDR-TB Al mondo 580.000 nuovi casi di MDR-RR/TB nel 2015, solo 340.000 riportati MDR: resistenza ad almeno 2 antibiotici di prima linea MDR-RR: resistenza a rifampicina La resistenza ai farmaci si sviluppa quando: l’assistenza sanitaria non è sufficiente I pazienti non completano la cura o la seguono in modo irregolare I farmaci sono di cattiva qualità e manifattura ed inefficaci Vorrei ora parlare di due questioni legate a questa epidemia globale. La prima: -MDR: pericolosa in quanto poco riportata: fa a tempo quindi a diffondere un contagio pericoloso e difficile da trattare ……… (Descrizione slide: 1. Cause. 2. MDR-TB da sola, senza RR-TB, è in linea con i dati dello scorso anno)

Distribuzione geografica dei nuovi casi di MDR-RR/TB 2015 ……… (Descrizione slide: distribuzione diversa da quella globale vista poco fa: ex USSR ) OMS Global TB Report 2016

Ceppi Mtb-R isolati da pazienti: WGS per migliorare la diagnosi di MDR-TB Sequenziamento di tutto il genoma (WGS) di 127 ceppi isolati da pazienti in 20 Paesi, resistenti a 4 farmaci: Isoniazide, rifampicina, etanbutolo e streptomicina. La maggior parte delle mutazioni individate riguardano 5 geni: rpoB (RNAPol, rifampicina), inhA promoter e katG (reduttasi e catalasi rispettivamente, isoniazide), rpsL (proteina ribosomale S12, streptomicina) ed embB (arabino-transferasi, etanbutolo). Per rpoB e katG è stata osservata un’associazione tra maggiore resistenza e minore distanza della mutazione dal sito di legame con il farmaco. Ciò può permettere di predire più rapidamente anche l’entità della resistenza, in base all’analisi delle mutazioni nei ceppi isolati dai pazienti. a) Residui aa mutati in rpoB. La molecola di rifampicina è in grigio e rosso -WGS arma potente per individuare mutazioni di rilevanza clinica: 127 casi clinici in questo studio -Rilevanza clinica deve essere poi confermata con approcci indipendenti (trasformazione plasmidi e allelic exchange) prima di impegnare risorse ingenti x diagnostici -Descrizione slide: inh A è reduttasi x biosintesi acido micolico; katG è catalasi, che attiva la pro-drug Phelan et al. BMC Medicine 2016. 14, 31 b) Residui aa mutati in katG. La molecola di isoniazide è in grigio, blu e arancio

TB e AIDS La pandemia dell’AIDS, in primo luogo nei Paesi dell’Africa australe, ha portato ad un nefasto incremento dei casi di tubercolosi. Le difese immunitarie sono molto importanti per mantenere la TB sotto controllo, come avviene nella TB latente. L’indebolimento delle difese immunitarie nei malati di AIDS (25% di sieropositivi per l’AIDS in alcuni Paesi dell’Africa australe!) porta alla riattivazione della TB latente. La seconda questione critica è la sinergia tra TB e AIDS dispiegatasi a partire dagli anni 90. Ho voluto mantenere questa vecchia diapo che illustra bene le dinamiche allora sviluppatesi. L’incidenza della TB nel mondo fino al 2003

TB e AIDS: distribuzione geografica della prevalenza di HIV in nuovi casi e in recidive di tubercolosi ……… (Descrizione slide) 74%in Africa subsahar, parallela alla distribuzione globale di TB, riflette la spinta data da HIV negli anni 90 alla diffusione della TB. In Africa sud-est, più del 50% dei malati di TB hanno l’AIDS. OMS Global TB Report 2016

TB e AIDS: gli sviluppi Incidenza TB nel mondo: 10,4 M nel 2015 Mortalità da TB nel mondo: 1,8 M nel 2015 -Oggi la crescita da sinergia è stata fermata. Ma il problema rimane ……… (Descrizione slide) -Da notare il marcato aumento dei casi riportati, che rende paradossale il confronto con i Report OMS degli anni precedenti OMS Global TB Report 2016

Strategia dell’OMS fino al 2035: Un mondo libero dalla TB Current global trend: -1,5%/year Riduzione incidenza: 2025: 50% 2035: 90% Riduzione mortalità: 2025: 75% 2035: 95% -Una diapo gentilmente messa a disposizione da Mario Raviglione, direttore del Global TB Programme dell’OMS -Sforzo di OMS si pone degli obiettivi …. (Descrizione slide sinistra) -Quanto possono incidere interventi più decisi? Proiezioni... (Descrizione slide destra)

E’ essenziale raggiungere presto i 4,3 milioni di casi totali di TB non riportati 10,4 mln stimati 6,1 mln riportati Gap: 4,3 mln Casi stimati Casi riportati Da OMS Global TB Report 2016 -Dire titolo … In quanto sono quelli che diffondono più rapidamente il contagio -… (Descrizione slide)

Gli interventi sanitari perseguibili oggi Strutture sanitarie diffuse capillarmente Farmaci efficaci e di buona qualità, per evitare l’insorgere di forme di resistenza Prezzi dei farmaci contenuti -Diffusione capillare: Importantissimo x raggiungere i 4,3 milioni - -Buona qualità: occorre che organizzazioni coinvolte curino in Partnership la produzione e distribuzione nei PVS evitando ogni contraffazione, un fenomeno diffuso e che favorisce le multiresistenze -Prezzi: Partnership di distribuzione

Prezzi bassi nei Paesi in via di sviluppo Le nuove Organizzazioni Internazionali Il controllo dei prezzi e il mantenimento della qualità dei farmaci richiedono uno sforzo comune da parte di Paesi, Aziende e Organizzazioni Internazionali Per raggiungere questo obiettivo e per reperire le risorse necessarie, emergono nuove forme di organizzazione internazionale, quali: TB Alliance International Drug Purchase Facility (UNITAID) Stop TB Partnership Global Fund to fight AIDS, Tuberculosis and Malaria Medicines for Malaria Venture Affordable Medicines Facility -… (Descrizione slide) …A partire dai primi anni 2000, si è delineato un nuovo panorama di Organizzazioni Internazionali in Partnership che curano tutti gli aspetti e i passaggi concreti della assistenza sanitaria mondiale su malattie globali e neglette -Dicevamo che: Le industrie private hanno paura di investire su malattie globali e neglette Le sovvenzioni statali finiscono spesso in mille rivoli di corruzione

Prezzi bassi nei Paesi in via di sviluppo Le nuove Organizzazioni Internazionali Le nuove organizzazioni coinvolgono molti partners: pubblici, privati, ONGs e OGs Sono basate su forte integrazione della cooperazione tra nord e sud del mondo Sono basate su progetti competitivi, svolti e seguiti con managment di qualità, perseguiti con obiettivi di efficienza e capacità innovativa Questi grandi progetti internazionali hanno lo scopo di innovare sia le organizzazioni sanitarie che i prodotti terapeutici o diagnostici I finanziamenti a pioggia sono il passato, e sono fonte di corruzione

Le nuove organizzazioni internazionali TB Alliance (Global Alliance for TB Drug Development) PHARMA BIOTECH ACADEMIA INSTITUTES GOVERNMENTS FOUNDATIONS Founded in 2000 Not-for-profit Product Development Partnership (PDP) headquartered in New York, with office in Pretoria Entrepreneurial, virtual approach to drug discovery and development Largest portfolio of TB drug candidates in history Focalizzata su R&D TB, non distribuzione …. (Descrizione slide 26 e 27)

TB Alliance Supporters 2016 2017 Bill & Melinda Gates Foundation United States Food and Drug Administration United Kingdom Department for International Development European Union United States Agency for International Development

TB Alliance Global Alliance for TB Drug Development Hit-to-Lead Lead Optimization Pre-Clinical I nuovi farmaci dopo 40 anni nascono da queste iniziative …. (Descrizione slide 28 e 29)

TB Alliance Global Alliance for TB Drug Development Clinical Development Program

Le nuove organizzazioni internazionali Stop-TB Partnership Nata nel 2001. Partners: OMS, NGOs, GOs, Privati Ha i seguenti obiettivi strategici: Facilitare collaborazioni fondate e continuative tra i partners per la realizzazione di progetti Aumentare l’impegno politico dei leaders mondiali e degli opinion leaders per incrementare I finanziamenti per la TB Promuovere l’innovazione nella assistenza sanitaria per la diagnosi e la cura della TB, attraverso TB REACH e altre piattaforme e meccanismi innovativi Assicurare l’accesso universale a farmaci e diagnostici per la TB, con una qualità assicurata, ai paesi serviti da GLOBAL DRUG FACILITY …. (Descrizione slide)

Stop TB Partnership Working Group on New TB Drugs -Spesso progetti in comune: Qui molto GATB e TBDA

A network model: TBDA structure Nature Reviews Microbiology 13, 651–657 (2015) The Tuberculosis Drug Accelerator (TBDA) is a virtual open lab organized as a network, the structure of which is still evolving. Each signatory organization may share information, compounds, services and other resources with the others. Some organizations are closely connected by mutual agreement to form teams. Crosstalk occurs between the teams as required. The Bill & Melinda Gates Foundation provides financial support to the non-industrial participants. Suppliers of additional compounds include members of the TBDA and members' collaborators. The companies involved (blue) are GlaxoSmithKline (GSK), Sanofi, Merck & Co. (Merck), Lilly, AbbVie, Bayer, Eisai, AstraZeneca, Celgene Global Health (CGH) and Anacor Pharmaceuticals. Academic institutions (orange) are the Weill Medical College of Cornell University (WMC; New York, USA), University of Cape Town (UCT; South Africa), Rutgers University (Rutgers; New Jersey, USA), the University of Dundee (Dundee; UK), Texas Agricultural and Mechanical University (Texas A&M; College Station, USA), Peking University (Beijing, China), the University of Kansas (Lawrence, USA) and Boston University (USA). The government laboratory (green) is the US National Institutes of Health (NIH). The research institute (pink) is the Infectious Disease Research Institute (IDRI). The non-governmental organization (purple) is the Global Alliance for TB Drug Development (TBA). .Leggere prime righe

Stop TB Partnership Working Group on New TB Drugs

https://vimeo.com/140902298

Le nuove organizzazioni internazionali. Un quadro globale Processo di sviluppo di servizi sanitari, dall’alto in basso: descrizione dal punto di vista di UNITAID

I programmi di cura e ricerca Nuovi diagnostici: la pipeline R&D in sviluppo WHO Global Tuberculosis Report 2016 Ad esempio test Xpert (permette anche MDR in poche ore) Test rapidi e facilmente eseguibili anche in assenza di strutture sanitarie. Test per valutare la MDR, ma anche per valutare la progressione di LTB. I più avanzati sono quelli che usano tecnologie molecolari, come PCR o microarray per readout multipli (pe, ampio numero di mutazioni TB-R). Tuttavia questi test molecolari spesso richiedono strutture sanitarie o personale esperto. Promettente è GeneXpert Omni, che legge TB e rifR-TB, di facile uso.

I programmi di cura e ricerca Nuovi antibiotici: la pipeline R&D per i farmaci in sviluppo -Molti antibiotici in sviluppo come mai prima: promettenti bedaquilina e delamanid in MDR - OMS nel 2016 raccomanda uno schema terapeutico MDR che accorcia il trattamento da 18-24 mesi a 9-12 mesi WHO Global Tuberculosis Report 2016

I programmi di cura e ricerca Nuovi vaccini: la pipeline dei 15 vaccini in sviluppo -La ricerca è considerata un pilastro della nuova strategia OMS, che indica un impulso forte ai programmi R&D. -BCG attuale scarsa efficacia. Un quadro dei vaccini in sviluppo, sono 15, fase 1 etc. -Quadro non diverso dallo scorso anno, riflette difficoltà, ma sono indicate scadenze WHO Global Tuberculosis Report 2016

Si stima che investimenti su TB daranno ritorni fino a 40 volte superiori

https://vimeo.com/158504088

TAKE-HOME MESSAGES La TB, come altre malattie globali, si può curare Globalmente, la elevata mortalità nasce da assistenza sanitaria insufficiente Per fare fronte a queste difficoltà occorre uno sforzo internazionale di partnership e cooperazione, con dispiego di risorse umane, scientifiche ed economiche La gestione di queste risorse deve essere di elevata qualità ed efficacia. I finanziamenti a pioggia sono il passato. I risultati stanno arrivando Usando questi approcci, gli ultimi anni hanno testimoniato progressi nella diagnosi e nella cura … Ma molta strada è ancora da percorrere…