Le molecole chiave dell’apoptosi Caspasi Bcl2 family IAP family Death Receptors

Bcl2-related proteins nei mammiferi: almeno 20 membri 3 sottofamiglie: - sottofamiglia Bcl-2: azione anti-apoptotica - sottofamiglia Bax: azione pro-apoptotica - sottofamiglia BH3-only:azione pro-apoptotica -”attivatori” (attivano bax) -”sensibilizzanti” (antagonizzano Bcl-2) proteine altamente conservate durante l’evoluzione (omologhi di Bcl-2 in c.elegans, drosophila, adenovirus , virus di Epstein-Barr)

omologo di Ced-9 di c.elegans, è stato il primo Bcl2 omologo di Ced-9 di c.elegans, è stato il primo membro della famiglia identificato traslocato nel linfoma follicolare (cellule B), viene a trovarsi sotto il controllo del promotore della catena pesante delle Ig -> overespressione che conferisce resistenza all’apoptosi è il primo oncogene che promuove la sopravvivenza cellulare invece che stimolare la proliferazione

BH1, BH2, BH3, BH4: regioni di alta omologia con Bcl-2 TM: regione transmembrana -> inserzione in membrana di nucleo, ER, mitocondri (ma possono essere anche citoplasmatiche) conferiscono protezione da: deprivazione di citochine, UV, radiazioni, farmaci chemioterapici BH1/2/3: recettore per il BH3 domain dei membri pro-apoptotici

Le proteine appartenenti alle sottofamiglie con azione pro-apoptotica sono state identificate principalmente in virtù della loro capacità di interagire con Bcl-2 TM BH1, BH2, BH3: regioni di omologia con Bcl-2 TM: regione transmembrana -> inserzione in membrana di mitocondri e ER (ma possono essere anche citoplasmatiche) molto simili a Bcl-2 per sequenza e struttura

sequenza in larga parte senza omologia con Bcl-2 scarsa omologia fra di loro -> unica regione conservata: BH3 (necessaria per la funzione pro-apoptotica)

Sensibilizzatori

Evoluzione delle ipotesi sul meccanismo d’azione delle proteine Bcl2

Regolazione mitocondriale da parte della Bcl2 family membri pro-apoptotici si legano al PTP —> apertura —> rilascio del citocromo c membri anti-apoptotici si legano al PTP —| apertura BH3-only inducono la oligomerizzazione di Bax o Bak sul mitocondrio —> canale —> rilascio del citocromo c membri anti-apoptotici —| oligomerizzazione e formazione del canale

Nuove ipotesi sui meccanismi di interazione proteina-proteina per la formazione di canali mitocondriali pro-apoptotici

La regolazione della permeabilità mitocondriale da parte della Bcl2 family e la sensibilità a farmaci antitumorali (A) Il trattamento in vitro delle varie linee cellulari leucemiche con un peptide pro-apoptotico causa un cambio della permeabilità mitocondriale (“priming dell’apoptosi”): la sensibilità all’etoposide è linearmente correlata con il priming

La manipolazione per shRNA dei livelli di Bcl2 proteins cambia la permeabilità (B) ed aumenta la sensibilità ai farmaci (D-E)

Correlazione fra priming e risposta clinica alla chemioterapia I campioni proveniente da pazienti leucemici che mostrano in vitro una migliore risposta di priming sono quelli che appartengono a pazienti che vanno in completa remissione (CR) e non recidivano (Cured).

Le molecole chiave dell’apoptosi Caspasi Bcl2 family IAP family Death Receptors

caspasi Cisteina aspartato-specifiche proteasi superfamiglia di 12 membri (nell’uomo) alto grado di omologia delle varie caspasi conservazione e aumento della complessità durante l’evoluzione: 3 caspasi in c.elegans (Ced-3 prima caspasi identificata), 4 in drosophila, 12 in roditori e uomo

Caratteristiche biochimiche delle caspasi sito attivo ben conservato QACys285XG assoluta richiesta di aspartico (D) in P1 del substrato suddivisione in base alla sequenze peptidica preferenziale di clivaggio: - gruppo I: caspasi-1, -4, -5, motivo WEHD - gruppo II: caspasi-2, -3, -7, motivo DXXD - gruppo III: caspasi-6, -8, -9, -10, motivo I/L/V/EXD

Esistono diversi tipi di caspasi con diversa funzione caspasi iniziatrici: si sono evolute per collegare distinte pathway di segnalazione a monte con pathway esecutrici a valle -> hanno un lungo prodomain contenente moduli caratteristici per l’interazione proteina-proteina. Sono in grado di autoattivarsi caspasi esecutrici: processate ed attivate dalle caspasi iniziatrici. Caratterizzate da un prodomain breve.

taglio tra subunità maggiore e minore (2-step) Asp Asp Asp prodomain LARGE subunit linker SMALL subunit taglio tra subunità maggiore e minore (2-step) separazione del prodomain dalla subunità maggiore caspasi attiva: omodimero composto da due monomeri, ciascuno composto da una subunità maggiore e una minore auto-attivazione trans-attivazione attivazione da altre proteasi (tra cui caspasi stesse)

taglio tra subunità maggiore e minore (2-step) separazione del prodomain dalla subunità maggiore caspasi attiva: omodimero composto da due monomeri, ciascuno composto da una subunità maggiore e una minore

Caspasi: ruolo nella esecuzione del programma apoptotico La proteolisi è responsabile delle alterazioni morfologiche che caratterizzano la morte cellulare apoptosica. Blocco delle attività delle caspasi (mutazioni o inhibitori) ritarda o previene la morte cellulare apoptosica.

Le molecole chiave dell’apoptosi Caspasi Bcl2 family IAP family Death Receptors

IAP family IAP = Inhibitor of Apoptosis Protein proteine endogene che funzionano come regolatori intrinseci della cascata delle caspasi legandosi alle caspasi (anche già attivate) ne inibiscono l’attività enzimatica e ne promuovono ubiquitinazione e degradazione le prime IAP furono identificate nel baculovirus -> conservate in drosophila e nei vertebrati

BIR domain: baculoviral IAP repeat (70-80 aa), responsabili per l’interazione con le varie caspasi. Interazioni con specifiche caspasi sono attribuite ai singoli BIR domains (BIR3-Casp9, BIR2-Casp3/7) RING Finger: Zn-finger domain capace di chelare due atomi di Zn. Si trova di solito in proteine che funzionano come E3-Ub ligasi (adattatori che reclutano un substrato per un enzima E2 specifico -> targeting per la degradazione proteasoma-mediata)

Regolatori negativi delle IAP proteine in grado di legare le IAP sopprimendone l’attività antiapoptotica XAF-1, XIAP-Associated Factor-1: legando XIAP blocca la sua azione inibitrice su Casp-3 e reverte la sua azione protettiva verso l’apoptosi indotta da chemioterapici. Espresso a buoni livelli in tutti i tessuti, è invece estremamente basso nella maggioranza delle linee cellulari di origine tumorale usate nella ricerca di laboratorio. La perdita dell’espressione di questa proteina nelle cellule trasformate potrebbe contribuire alla maggior resistenza all’apoptosi che caratterizza le cellule tumorali.

Smac, second mitochondria-derived activator of caspases. Proteina normalmente residente all’interno del mitocondrio e rilasciata nel citoplasma durante il processo apoptotico. E’ un dimero in grado di legarsi a XIAP, IAP-1/-2 e Survivin Si lega agli stessi BIR domain legati dalle caspasi -> inibisce l’azione antiapoptotica delle IAP per competizione o spiazzamento.

Le molecole chiave dell’apoptosi Caspasi Bcl2 family IAP family Death Receptors

Death Receptors (e loro ligandi) recettori di superficie che appartengono alla superfamiglia dei recettori di TNF/NGF trasducono un segnale apoptotico all’interno della cellula in seguito all’interazione con una serie di specifici ligandi, strutturalmente correlati fra di loro proteine transmembrana di tipo I organizzate in: - regione extracellulare N-term, responsabile del legame con il ligando specifico - regione transmembrana - regione intracellulare C-term, responsabile della trasduzione del segnale

omologia significativa nel domain extracellulare -> 1-5 Cys-rich repeats (Ig-like) e nel domain citoplasmatico -> 60-80aa che costituiscono il cosiddetto Death Domain (DD), modulo di interazione proteina-proteina che permette l’interazione con proteine adattatrici e la trasduzione del segnale apoptotico

interazione della porzione extracellulare con uno specifico ligando Attivazione dei DR interazione della porzione extracellulare con uno specifico ligando trimerizzazione del recettore -> recettore funzionale formazione del DISC (Death Inducing Signaling Complex): reclutamento alla porzione intracellulare di una proteina adattatrice -> FADD (Fas, DR4, DR5) -> TRADD (TNF-R1, DR3) che recluta poi FADD FADD a sua volta interagisce con molecole effettrici (caspasi) L’interazione di FADD e TRADD con recettori, altri adattatori ed effettori è mediata da un modulo di tipo DD

I ligandi dei DR citochine che appartengono alla famiglia del TNF proteine transmembrana di tipo II organizzate in: - regione extracellulare C-term, responsabile del legame al recettore specifico - regione transmembrana - regione intracellulare N-term possono essere rilasciati in forma solubile in seguito al taglio della porzione extracellulare ad opera di metalloproteasi

TNFR1 ed i suoi vari pathways modulatori

TRAIL-R e TRAIL TRAIL: TNF-Related Apoptosis Indicing Ligand, è il ligando della famiglia con la più alta omologia con FasL, ed è espresso costitutivamente in molti tessuti. Induce apoptosi più efficientemente in cellule tumorali rispetto a cellule normali (differente regolazione del signaling intracellulare post-recettore). TRAIL-R: identificati 5 recettori ma solo due inducono apoptosi quando legano TRAIL (TRAIL-R1/DR4 e TRAIL- R2/DR5). Entrambi sono espressi nella maggiorparte dei tessuti umani normali e tumorali (TRAIL-R2 più espresso nei tessuti linfoidi). Due sono cosiddetti decoy receptors (TRAIL-R3/DcR1 e TRAIL-R4/DcR2) mancanti di DD ed espressi solo nelle cellule normali (competizione per il ligando). L’ultimo recettore è OPG (che lega anche un altro membro della famigliaTNF) ma non induce apoptosi

Il pathway di TRAIL

TRAIL ricombinante é tossico solo per cellule tumorali MDA-231, mam-mary adenocarcinoma; HMEC, human mam-mary epithelial cells; RPTEC, human renal proximal tubule epithelial cells; NHLF, normal human lung fibroblasts; SkMC, human skeletal muscle cells; NHA, normal human astrocytes.

TRAIL non induce apoptosi nelle cellule normali (topo) in vivo Controllo TRAIL FAS-L

TRAIL causa regressione tumorale in vivo

TRAIL induce apoptosi delle cellule tumorali in vivo

TRAIL potrebbe essere un farmaco efficace? Iniziali studi clinici: TRAIL induce apoptosi delle cellule tumorali, ha scarsi effetti collaterali Molti casi sono resistenti o sviluppano resistenza durante il trattamento

Cross-talk tra via estrinseca ed intrinseca Bid viene proteolizzato dalla Casp8 attivata (via estrinseca) T-Bid può associarsi con membri della Bcl2 family, ed attivare la via intrinseca La combinazione delle due vie è necessaria per attivarel’apoptosi in alcune cellule

Le molecole chiave dell’apoptosi Caspasi Bcl2 family IAP family Death Receptors

p53 has a key role in integrating the cellular responses (pink boxes) to different types of stress (blue boxes). Activation of p53 can result in a number of cellular responses, and it is possible that different responses are induced by different stress signals. There is evidence that p53 can play a part in determining which response is induced through differential activation of target-gene expression. Although the importance of these responses to tumour suppression is clear, previously unanticipated contributions of these responses to other aspects of human health and disease are being uncovered. The role of p53 in tumour suppression, development and ageing is likely to depend on which cellular response is activated and on the context in which the activation occurs.

P53 tumor suppressor mutata nel 50% di tumori umani: è la lesione genetica più frequente le mutazioni osservate nei tumori clusterizzano principalmente nella regione responsabile del legame al DNA conservata nei vertebrati, possiede omologhi anche in drosophila e c.elegans

organizzata in 4 domain funzionali, la sua funzione è finemente regolata a più livelli: - fosforilazione, acetilazione-> degradazione è un fattore di trascrizione ed agisce in forma di omotetramero regola la trascrizione di gruppi di geni coinvolti in - arresto del ciclo cellulare - apoptosi - senescenza

proteina molto instabile, i cui livelli sono mantenuti costantentemente bassi all’interno della cellula tramite degradazione mediata dalla proteina Mdm2 i suoi livelli cellulari aumentano per mancata degradazione (inattivazione di Mdm2) aumento in seguito a danno del DNA (UV, raggiX, chemioterapici) -> due principali conseguenze: - arresto del ciclo cellulare (danno moderato) - apoptosi (danno forte)

PUMA NOXA

Un ruolo inaspettato per p53 nell’induzione di necrosi Dopo stress, p53 si trova localizzata insieme con la ciclofilina-D ai mitocondri

P53 è richiesta per l’apertura del PTP durante la necrosi da stress ossidativo Viene misurata l’apertura del PTP

Lo stress ossidativo induce necrosi e non apoptosi che dipende da p53

Considerazioni P53 è un regolatore fondamentale dell’apoptosi, ma sembra giocare un ruolo altrettanto rilevante nella morte cellulare da necrosi dopo stress ossidativo P53 è “good” e “bad”: in questo caso potrebbe essere coinvolto nella patogenesi di molte malattie Il coinvolgimento di p53 è un’altra dimostrazione che anche la necrosi è sottoposta (almeno in alcuni casi) a un livello di regolazione impensabile fino a poco tempo fa

Cytoskeletal Reorganization for Engulfment Apoptosis and Phagocytosis Phagocytes recognize “eat-me” or cell corpse signals on the apoptotic cell surface. These signal the phagocyte to activate cellular engulfment machinery. Phosphatidylserine exposure on the target cell surface and the phosphatidylserine receptor on the phagocyte are essential for phagocytosis. Defining other receptors, bridge molecules, “eat-me” signals and signaling molecules involved in initiating the cytosolic changes needed for engulfment are very active areas of research. The articles listed below review current knowledge and are the sources for this diagram. Phagocyte Apoptotic Cell RAC-1 DOCK 180 CRKII ELMO Cytoskeletal Reorganization for Engulfment C1q Receptor Bridge C1q C1q Binding Site PS Phosphatidyl- serine Receptors Scavenger Receptors ? Oxidized LDL-like Site Savill, J. and Fadok, V. 2000. Nature. 407:784. Canradt, B. 2002. Nature Cell Biol. 4:E139.

PANX1 channels control the passage of molecules across the membrane in viable cells (green arrows). When cells die by apoptosis, membrane-bound fragments called apoptotic bodies bud off from the cell. PANX1 channels release ATP molecules from the cell and allow entry of selected molecules such as the fluorescent dye TO-PRO-3 (blue arrows). ATP acts as a 'find-me' signal to phagocytes that engulf both the dying cell and the apoptotic bodies. b, Poon et al.1 report that PANX1-channel function is inhibited by the antibiotic trovafloxacin, which modulates the channel's activity in viable cells (red arrows). Channel inhibition also results in the formation of many more apoptotic bodies during apoptosis, leading to dysregulated fragmentation of the cell. The study reveals that apoptotic bodies form in association with string-like structures, termed apoptopodia.

Pathways anti-apoptotici