La scelta del sistema cellulare coltura primaria cellula immortalizzata linea tumorale

Scelta del sistema cellulare. 1. Facilità di coltura e stabilità 2. Efficienza di transfezione 3. Modificazioni post-traduzionali 4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica 5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)

Scelta del vettore per ingegneria cellulare

Vettori per ingegneria cellulare sequenze per la replicazione in procariote Cassetta di espressione Polylinker Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.) Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione; poliadenilazione; segnali di splicing ) Marcatori di selezione

• SV40 origin for episomal replication and simple vector rescue in cell lines expressing the large T antigen (i.e., COS-1 and COS-7)

Transfezione stabile Marker di selezione: Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione. Marker di selezione: Crescono solo le cellule che hanno acquisito il vettore Creazione di linee stabili

Caratteristiche del gene marker: - deve esprimersi in un’ampia gamma di cellule e tessuti deve produrre una chiara modificazione del fenotipo - deve distinguersi perfettamente da attività endogene simili - la resistenza endogena al composto selettivo deve essere bassa deve potersi esprimere a livelli sufficienti per garantire la resistenza l’enzima prodotto deve inattivare il composto ad alta velocità - i metaboliti liberati dopo la reazione non devono essere tossici.

I markers di selezione sono geni che neutralizzano l’effetto di farmaci tossici Lista di markers di selezione frequentemente utilizzati negli eucarioti superiori neo R – neomycin (G418, neomycin (G418, analogo analogo della Neomicina Neomicina solfato solfato ) hyg R – hygromycin pac R – puromycin zeo R – zeomycin

Geni per markers selettivi: aminoglicoside fosfotransferasi (Neo): conferisce resistenza agli antibiotici aminoglicosidici (kanamicina, neomicina, geneticina…). Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezionare le cellule sono necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche le cellule trasfettate necessario determinare la dose appropriata. Igromicina B fosfotransferasi: conferisce resistenza all’igromicina (Hyg) Hygromycin B is an aminoglycosidic antibiotic that inhibits protein synthesis by disrupting translocation and promoting mistranslation at the 80S ribosome.  Resistance to Hygromycin B is conferred by the E. coli hygromycin resistance gene (hyg or hph).

Geni per markers selettivi: Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro interesse oppure co-trasfettato con un secondo plasmide. timidina chinasi (Tk): enzima che permette la sintesi della timidina. Si selezionano cellule Tk- che vengono poi trasfettate con il plasmide Tk+. In un terreno –timidina crescono solo le cellule che hanno acquisito il plasmide. - sono poche le cellule Tk- e non è detto che vadano bene per il nostro studio asparagina sintetasi xantina-guanina fosforibosil transferasi

Timidino chinasi Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio” L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile 5-fosforibosil-1-pirofosfato Uridina monofostato Inosina monofostato Timidina monofostato AMINOPTERINA Guanina monofostato Adenina monofostato Ipoxantina Timidina

Sito di poliadenilazione RNApol II trascrive anche il sito di poliadenilazione, parte della porzione 3' viene rimossa e l'RNA poliadenilato. Le sequenze downstream devono essere incluse nei vettori di espressione degli eucarioti per avere la sintesi di mRNA Due elementi indispensabili per corretta POLIADENILAZIONE sequenze ricche di GU o U downstream il sito di poliadenilazione; sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate 11-30 nucleotidi upstream il sito di poliadenilazione

La scelta del vettore Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare: iperespressione proteica 2. espressione regolata per studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo 3. studio della regolazione della espressione di un gene

Scopo della trasfezione Indagini sulla funzionalità di un gene/proteina PROMOTORE STD + GENE D’INTERESSE PROMOTORE Gene XYZ

Scopo della trasfezione 2. Studio attività-funzione di una proteina - promotore forte, cellula-specifico + gene per quella proteina PROMOTORE Gene XYZ FEGATO PROMOTORE Gene XYZ POLMONE

Scopo della trasfezione 3. Controllo dell’espressione genica: indagini sulla regolazione del promotore PROMOTORE DEL GENE DI INTERESSE + GENE REPORTER PROMOTORE REPORTER

Scopo della trasfezione 4. Studi di attività trascrizionale: vettore promoterless Promotore con inserzione + reporter Enhancer + Promotore + reporter Promotore deleto + reporter Promotore + reporter

Reporter : Le cellule con il vettore acquisiscono particolari caratteristiche Funzionalità di un promotore: reporter posto sotto il controllo di quel promotore Funzionalità di un gene: Fusione del gene d’interesse con il gene reporter Entrambi posti sotto la regolazione dello stesso promotore

Caratteristiche di un reporter NON deve avere un’attività proteica SIMILE a quella del gene d’interesse l’attività proteica del Reporter NON deve INTERFERIRE con quelle fisiologiche della cellula: le vie di segnalazione e il metabolismo cellulare devono rimanere integri il saggio sull’attività del reporter deve essere specifico; riproducibile immediato

geni reporter GFP: green fluorescent protein espresso nella medusa Aequorea Victoria in natura produce bioluminescenza dovuta al trasferimento di energia (processo Ca-dipendente associato alla proteina Aeqorina) l’esposizione della proteina a raggi ultravioletti produce autofluorescenza di colore verde in assenza di Ca, Aequorina o qualunque cofattore o substrato mutazioni puntiformi nel cromoforo producono varianti che emettono luce a differente lunghezza d’onda CFP (cyan, colore blu) YFP (yellow, colore giallo)

geni reporter ß-galattosidasi: Codificato dal gene LacZ di E.coli Conversione di alcune sostanze in composti colorati Citochimica: clivaggio del substrato XGal → comparsa di precipitati BLU (colonie blu) Spettroscopia: clivaggio di ONPG (o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside ) → composto solubile giallo

Corte sequenze nucleotidiche Danno inizio alla trascrizione MCS Vettore PLASMIDE VIRUS (infezione) Promotore: Corte sequenze nucleotidiche Danno inizio alla trascrizione Enhancer: elementi di regolazione positiva Derivati da virus SV40 early gene enhancer: attivo su molti tipi cellulari LTR: long terminal repeat Raus Sarcoma Virus CMV Silencer: elementi di regolazione negativa Fattori per la replicazione: cis, trans

geni reporter Cloramfenicolo acetil-transferasi: Enzima batterico: resistenza all’antibiotico cloramfenicolo Acetilazione del Cloramfenicolo Se si usa come substrato l’antibiotico marcato con C14, viene acetilato solo nelle cellule trasfettate e dove il promotore che controlla l’enzima è attivo. Si produce una miscela di molecole marcate rilevate su TLC o autoradiografia Esempio: ANALISI TLC IL Clone A non ha attività acetilasica I Cloni B e C hanno attività acetilasica clone A clone B clone C

Luciferasi: luciferina + ATP luciferil adenilato + Ppi luciferil eadenilate + O2 ossiluciferina + AMP + LUCE

APPLICAZIONI SISTEMI INDUCIBILI SILENZIAMENTO GENICO

I sistemi inducibili permettono di regolare l’espressione di un gene richiedono espressione stabile del gene che si vuole regolare permettono di studiare l’espressione di geni tossici: si possono ottenere linee cellulari trasfettate stabilmente col gene da studiare che viene: - mantenuto “spento” in propagazione - “acceso” al momento dell’esperimento

Tet system: TET-ON e TET-OFF Sistemi regolati dalla tetraciclina (Tc) o da suoi analoghi come la doxyciclina (Dox). Tet-On: l’aggiunta di Tc o Dox accende il nostro gene Tet-Off: l’aggiunta di Tc o Dox mantiene spento il nostro gene Sistemi sfruttano le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline: Tet R= tet repressor protein: regola negativamente l’espressione dei geni coinvolti nella resistenza (trasposone Tn10). In assenza di Tc, Tet R si lega alla sequenza Tet O=tet operator e blocca la trascrizione. Per gli exp in cell di mammifero Tet R è stata modificata:

nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc o Dox nel medium per mantenere lo stato inattivo. Le due molecole però hanno emivita breve ed è quindi necessario aggiungerle ogni circa 48 h per reprimere l’espressione del gene X.

esempio: NSC34-Tet Off