Spectrophotometry Instrument is called a Spectrophotometer http://campus.murraystate.edu/academic/faculty/judy.ratliff/UV-Vis2.htm Instrument is called a Spectrophotometer Measures the light that passes through a liquid sample Spectrophotometer gives readings in Percent Transmittance (%T) and in Absorbance (A)

Protein Concentration Lowry ( most cited reference in biology) Color assay A280 Intrinsic absorbance Relies on aromatic amino acids BCA Modification of Lowry: increased sensitivity and consistency Bradford Shifts Amax of dye from 465nm to 595nm

A280 Uses intrinsic absorbance Detects aromatic residues Resonating bonds Depends on protein structure, native state and AA composition

Beer-Lambert Law A = Ecl where: “A” is Absorbance “E” is Molar Extinction coefficient of solute “c” is solute concentration “l” is the length of the light path For a given solute and spectrophotometer, “E” and “l” are constants Let E x l = k (k is a constant) Beer-Lambert Law becomes A = kc Absorbance proportional to solute concentration

Quali sono i gruppi cromofori presenti nelle proteine?   A) Nei legami peptidici si osservano le seguenti transizioni: 1) n ® p* a 210-220 nm  ,   dai livelli di non legame n a quelli di antilegame p* 2) p ® p* a 190-210 nm , da un livello di legame p  ad uno di antilegame p* 3) n ® s*  a 175 nm , dai livelli di non legame n a quelli di antilegame s* B) Nelle catene laterali: a parte le transizioni comuni al legame peptidico e quindi poco osservabili, sono da ricordare i gruppi aromatici (260-280 nm), Trp, Tyr, Phe C) I gruppi prostetici

Quali sono i fattori che influenzano le proprietà di assorbimento di un cromoforo? pH - il pH del solvente determina lo stato di ionizzazione di cromofori ionizzabili 2) la polarità - per cromofori polari, il valore di λmax per le transizioni n ® p* è minore in solventi polari (H2O, alcool) e maggiore in solventi non polari. 3) caratteristiche geometriche - la diversa organizzazione strutturale dei gruppi cromofori influenza fortemente sia ε che λmax.

Determinazione della concentrazione proteica Lettura dell'assorbanza a 280 nm vantaggi: rapido, non distruttivo svantaggi: non quantitativo, poiché il metodo è basato sull'assorbimento degli aminoacidi aromatici; i coefficienti di estinzione molare saranno quindi molto diversi da proteina a proteina. Inoltre c'è una forte interferenza degli acidi nucleici. sensibilità:  0.2-2 mg/ml (scarsa)   Correzione per acidi nucleici:      Cproteine (mg/ml) = 1,5 x A280- 0.75 x A260 Tempo : pochi minuti

La colorimetria Numerose sostanze non hanno un coefficiente d'estinzione significativo nel visibile, ma possono reagire quantitativamente con un'altra sostanza a formare un prodotto colorato. Questa proprietà viene sfruttata per la determinazione quantitativa di tali sostanze. La formazione del prodotto colorato (cromoforo) deve avvenire in condizioni standardizzate secondo un rapporto stechiometrico con la sostanza e si misura quindi l'estinzione dei campioni rispetto a quella di un bianco, contenuto nella cuvetta di riferimento e costituito da tutti i reagenti tranne la sostanza da determinare.

E' necessario prima della misurazione dei vari campioni azzerare contro il bianco. Si pongono poi i valori delle varie letture in funzione della quantità o della concentrazione della sostanza in esame che forma il prodotto colorato. Questo grafico è la curva di taratura. A questo punto è possibile dosare quantità ignote della sostanza facendo avvenire la reazione colorimetrica nelle stesse condizioni, misurando l'estinzione ed estrapolando l'altro valore dalla curva di taratura.  

metodo del biureto (interesse storico) Biureto:  Principio: in soluzione alcalina lo ione Cu+2 forma complessi colorati in "blu" con i legami peptidici. Sale normalmente usato CuSO4. The result is a purple color. Sensibilità : bassa 1 mg/ml Tris buffer and other substances often interfere.

Chemistry of the Lowry Assay Two reactions make the blue color develop: Reaction 1 Cu2+ + peptide bonds  Cu1+-peptide bond complex Produces purple-blue color Reaction 2 Folin reagent + Cu1+-complex  reduced Folin reagent Produces blue-green color

Lowry ®  in aggiunta al sale di rame c'é il reattivo di Folin - Ciocalteau (fenoli) che forma compelssi colorati con Tyr a pH 10-10.5 ® soluzione alcalina Vantaggi:riproducibilità, piccole variazioni fra proteine differenti Svantaggi: Molte sostanze possono interferire, reazioni lente (40 minuti), campione non recuperabile perché denaturato Sensibilità: 0.5-10 μg/ml Retta di taratura con BSA (Albumina di Siero Bovino) Lunghezza d'onda: 750 nm

Protein Determination Il metodo Bradford Questo metodo è molto popolare perchè semplice, rapido, economico e sensibile. Esso si basa sull'azione del Coomassie brilliant blue G-250 (CBBG) che si lega specificatamente a residui di arginina, triptofano, tirosina, istidina e fenilalanina. Da notare che agisce primariamente con i residui di arginina ( 8 volte più che con gli altri residui elencati). Il CBBG si lega a questi residui in una forma anionica, con assorbanza massima a 595 nm. Il colorante nella soluzione madre si trova infatti in forma cationica che ha un massimo di assorbanza a 470 nm.

The Bradford Assay Protein sample Mix and wait 5+ minutes High protein Read A595 Add Dye Reagent Protein sample Low protein No protein

metodo di Bradford Principio:  Il colorante Coomasie Blue forma composti colorati in "blu" con le proteine, tramite legami elettrostatici proteina-gruppi sulfonici del colorante in soluzione acida. Vantaggi: rapidità (5 minuti), sensibilità Svantaggi: qualche variabilità fra proteine diverse , campione non recuperabile perché denaturato. Sensibilità: 2-20 μg/ml Retta di taratura: con BSA Lunghezza d'onda: 595 nm

Protein Determination The BCA (Bicinchoninic Acid) Method Uses a similar principle as that described in the biuret reaction except that BCA is included and sensitivity is increased. This process is a two-step reaction. Protein + Cu2+ + OH- Cu1+ Cu1+ + 2 BCA Cu1+/BCA chromophore (562 nm). Pierce Protein Assay Technical Handbook, 1999

Using Standard Curve Protein unknowns: Protein (g) A750 33 0.200 92 0.550