CROMATOGRAFIA Consente la separazione dei singoli costituenti di una miscela, anche molto complessa. Sfrutta la diversa attitudine di ogni molecola o ione a distribuirsi tra due diverse fasi. Solitamente una delle due fasi viene immobilizzata ed è denominata fase stazionaria, mentre l’altra scorre continuamente sulla precedente ed è denominata fase mobile. Ogni specie chimica si distribuisce dinamicamente tra le due fasi in misura proporzionale alla diversa affinità che possiede per esse. Il grado di ritenzione di ogni specie chimica in colonna dipende dal coefficiente di distribuzione K. K = Cs/Cm CS concentrazione nella fase stazionaria CM = concentrazione nella fase mobile

SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA Solvente fresco (eleunte) Banda iniziale con i soluti A e B Impaccamento della colonna (fase stazionaria) sospesa nel solvente (fase mobile) Disco poroso Solvente in uscita (eluato) B in uscita A in uscita SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

MECCANISMI DI SEPARAZIONE

MECCANISMI DI SEPARAZIONE

MECCANISMI DI SEPARAZIONE FASE LEGATA La fase stazionaria è chimicamente legata ad un supporto inerte, ad esempio silice. Sulla base della polarità della fase mobile e stazionaria si distingue in: FASE NORMALE fase stazionaria polare (es. nitrile alchilico o alchilammina); fase mobile non polare (es. esano). FASE INVERSA fase stazionaria non polare (es. octasilano,OS, o octadecilsilano, ODS; fase mobile polare (es. H2O/acetonitrile o H2O/metanolo).

- - + + Hydocarbons Ethers Esters Ketones Aldehydes Amides polarità Hexane Carbon tetrachloride Toluene Diethyl ether (ether) Chloroform Methylene chloride Tetrahydrofuran (THF) Acetone Ethyl acetate Isopropanol Ethanol Acetic acid Methanol Acetonitrile Water polarità - + Hydocarbons Ethers Esters Ketones Aldehydes Amides Amines Alcohols Water polarità - +

PARAMETRI CROMATOGRAFICI SELETTIVITA’ (a): capacità di un sistema cromatografico di distinguere due specie chimiche. a = K1/K2 EFFICIENZA: capacità di un sistema cromatografico di mantenere compatta la banda di eluizione lungo tutto il percorso della fase mobile. L’efficienza è correlata al numero di piatti teorici della colonna. RISOLUZIONE (R): selettività ed efficienza insieme determinano il grado di risoluzione di un sistema cromatografico. CAPACITA’: numero massimo di picchi risolvibile da un sistema cromatografico SIMMETRIA: è correlata alla forma del picco Simmetria = forma del picco = b/a Efficienza = N piatti teorici = 16 (V2 / W2)2 Risoluzione = R = 2 (V2 - V1) / (W1 + W2)

colonna detector cromatogramma iniettore pompa

Fase stazionaria

Loop

DETECTORS Detector UV-VIS Il detector UV/VIS utilizza un monocromatore per selezionare la particolare lunghezza d’onda che attraverserà il campione. Si tratta di un comune spettrofotometro che permette di misurare lunghezza d’onda e intensità della radiazione assorbita nella regione dell’ultravioletto vicino e del visibile da parte di un campione. La concentrazione di un analita in soluzione può essere determinata misurando l’assorbanza ad una determinata lunghezza d’onda e applicando la legge di Beer- Lambert. La sorgente luminosa è solitamente una lampada al deuterio (luce UV) o al tungsteno (luce visibile). Le lunghezze d’onda sono selezionate mediante un prisma o un monocromatore.

DETECTORS Detector a diodi Il detector a diodi fa passare tutte le lunghezze d’onda attraverso il campione e poi focalizza ogni lunghezza d’onda su un singolo elemento sensore. Il detector a diodi presenta 2 vantaggi principali rispetto al detector UV-VIS: 1) Permette la selezione di un certo numero di lunghezze d’onda per l’analisi, caratteristica particolarmente importante quando non esistono informazioni disponibili sull’assorbimento dell’analita alle diverse lunghezze d’onda. 2) Il 2° vantaggio è legato alla purezza del picco. Spesso la forma del picco non dà alcuna informazione se il picco stesso corrisponda a due o più composti. In tal caso la possibilità di registrare contemporaneamente l’assorbanza a diverse lunghezze d’onda permette di valutare la purezza del picco.

DETECTORS Detector a fluorescenza La fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze eccitate da una radiazione di una certa energia di emettere radiazioni di energia inferiore (cioè di l più elevata). Alcune sostanze danno luogo a fluorescenza naturale, ma è possibile formare derivati altamente fluorescenti mediante reazioni di derivatizzazione. E’ formato da una sorgente (a deuterio) di radiazioni. I filtri selezionano la l della radiazione di eccitazione che viene focalizzata sulla cella di flusso. Le radiazioni di fluorescenza che vengono emesse vengono raccolte e inviate ad un sistema ottico e trasformate in un segnale la cui intensità è proporzionale alla concentrazione del soluto che l’ha prodotta ed infine. I detectors a fluorescenza sono probabilmente i più sensibili strumenti di rivelazione esistenti. In genere, la sensibilità è 10-1000 volte superiore a quella di un detector UV L’intensità della fluorescenza dipende sia dalla lunghezza d’onda d’eccitazione sia da quella di emissione.

DETECTORS Detector elettrochimico Sono utilizzati nella rivelazione di soluti presenti in forma ionica e suscettibili di essere ossidati o ridotti con facilità. Il detector elettrochimico è basato sulla misura della corrente risultante dalle reazioni di ossidoriduzione dell’analita da parte di un elettrodo adatto. Poiché il livello della corrente è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’analita, questo tipo di detector può essere utilizzato per la quantificazione. L’eluente deve contenere elettroliti ed essere un conduttore elettrico. La maggior parte delle analisi richiede un controllo del pH. La purezza dell’eluente è molto importante poiché la presenza di ossigeno e metalli può determinare una significativa corrente di fondo e quindi rumore e deriva della linea di base.

DETECTOR Un detector deve possedere le seguenti caratteristiche: elevata sensibilità, linearità, riproducibilità. Esistono differenti tipi di detector: UV/Vis, a diodi, elettrochimico. Il detector UV/VIS utilizza un monocromatore per selezionare la particolare lunghezza d’onda che attraverserà il campione. Il detector a diodi fa passare tutte le lunghezze d’onda attraverso il campione e poi focalizza ogni lunghezza d’onda su un singolo elemento sensore. Il detector elettrochimico utilizza un potenziale applicato tra una serie di elettrodi e misura la capacità di ossidare o ridurre una molecola.