La tecnologia del DNA ricombinante Isolare Analizzare i geni Modificare

PCR (polymerase chain reaction) 2 metodi per isolare geni di interesse In vitro (1983) In vivo (1973) Clonaggio genico PCR (polymerase chain reaction)

Clonaggio genico. Fasi 1. Isolamento del frammento di DNA di interesse (DNA genomico, di sintesi, cDNA) 2. Unione del frammento di DNA al vettore di clonaggio 3. Trasferimento del vettore ricombinante alla cellula ospite 4. Identificazione delle cellule che contengono la molecola ricombinante

FENOMENO DELLA RESTRIZIONE 1. Isolamento del frammento di DNA di interesse. Gli enzimi di restrizione FENOMENO DELLA RESTRIZIONE Alcuni ceppi batterici sono immuni dall’infezione da parte di batteriofagi in quanto contengono enzimi capaci di degradare il DNA fagico (enzimi di restrizione) senza che venga danneggiato il DNAdell’ospite batterico. I batteri modificano il proprio DNA attraverso la metilazione rendendolo così insensibile all’azione degli enzimi di restrizione.

Digestione del DNA con gli enzimi di restrizione

Estremità adesive complementari

Unione del frammento di DNA al vettore Il vettore ricombinante

2. Vettori di clonaggio. Proprietà. Molti vettori utilizzabili per il clonaggio sono stati ottenuti modificando plasmidi presenti in natura Plasmidi: “repliconi” : molecole capaci di replicazione autonoma Origine della replicazione Marcatore selezionabile UNO O PIU’ GENI CHE CONFERISCONO LA RESISTENZA AD ANTIBIOTICI Uno o più siti di restrizione unici POLYLINKER

polylinker sequenze uniche di riconoscimento per diverse endonucleasi di restrizione che permettono l’inserzione del DNA eterologo questo elemento facilita il lavoro di clonaggio permettendo di utilizzare l'enzima di restrizione più conveniente.

Il batteriofago l come vettore

COSMIDI PLASMIDI RICOMBINANTI CHE UNISCONO LE CARATTERISTICHE DEI PLASMIDI TRADIZIONALI E QUELLE DEL BATTERIOFAGO  SONO PICCOLE MOLECOLE DI DNA CIRCOLARE (5000-7000 bp) CHE CONTENGONO: UN ORIGINE DI REPLICAZIONE UNO O PIU’ MARCATORI DI SELEZIONE UN POLYLINKER UN SITO COS

CONSENTONO IL CLONAGGIO DI FRAMMENTI DI DNA MOLTO LUNGHI (FINO A 45000 bp) NELLA CELLULA INFETTATA IL COSMIDE TORNA A MOLTIPLICARSI COME UN NORMALE PLASMIDE NON PUO’ FORMARE PARTICELLE FAGICHE IN QUANTO NON POSSIEDE I GENI STRUTTURALI DI  I BATTERIOFAGI ED I COSMIDI SONO UTILIZZATI COME VETTORI PER LA COSTRUZIONE DI LIBRERIE GENOMICHE

PROCEDURA di CLONAGGIO ISOLAMENTO DEL GENE Idrolisi con enzimi di restrizione INSERZIONE DEL GENE IN UN VETTORE PLASMIDICO Ligasi INTRODUZIONE DEL VETTORE PLASMIDICO IN CELLULE VIVENTI PER PROPAGARLO Trasformazione

DNA LIGASI DOPO AVER TAGLIATO (E ISOLATO) SPECIFICI FRAMMENTI DI DNA, IL PASSO SUCCESSIVO DI UN CLONAGGIO CONSISTE NEL “CUCIRLI” TRA LORO IN MODO COVALENTE. DNA LIGASI: PERMETTE L’UNIONE DI DUE MOLECOLE O FRAMMENTI DI DNA TALE ENZIMA LEGA COVALENTEMENTE L’ESTREMITA’ 5’ FOSFATO DI UNA BASE CON L’ ESTREMITA’ 3’ FOSFATO DELLA BASE SUCCESSIVA

LA DNA LIGASI E’ UN ENZIMA CHE LEGA COVALENTEMENTE DUE MOLECOLE DI DNA QUESTA PROPRIETA’ E’ SFRUTTATA PER PRODURRE MOLECOLE DI DNA RICOMBINANTE DUE TRATTI DI DNA CHE IN NATURA NON SONO ADIACENTI, VENGONO UNITI IN PROVETTA. LA DNA LIGASI E’ UN ENZIMA CHE LEGA COVALENTEMENTE DUE MOLECOLE DI DNA G AATTC CTTAA G 5’ 3’ OH P G CTTAA AATTC GAATTC CTTAAG

FOSFATASI ALCALINA inserto ENZIMA CHE RIMUOVE IL GRUPPO FOSFATO AL 5’ IN MOLTI CASI, PUR OTTIMIZZANDO LA REAZIONE DI LIGASI, NON SI RIESCE AD EVITARE UNA ELEVATA FREQUENZA DI RICIRCOLARIZZAZIONE DEL VETTORE (QUANDO IL VETTORE E L’INSERTO SONO TAGLIATI CON UN SOLO ENZIMA DI RESTRIZIONE). AATTC TTAAG -5’P 3’OH P-5’ HO-3’ vettore inserto LA DEFOSFORILAZIONE DEL VETTORE CON LA FOSFATASI ALCALINA IMPEDISCE LA RICIRCOLARIZZAZIONE DEL VETTORE SENSIBILE ABBASSAMENTO DEL BACKGROUND POICHÉ IL VETTORE DEFOSFORILATO NON PUÒ ESSERE LIGATO.

ESEMPIO ESTREMITÀ “STICKY” 5’ PROTUDING (ES.ECORI) FILLING IN NEL CORSO DEI CLONAGGI PUÒ CAPITARE DI DOVER TRASFORMARE ESTREMITÀ COESIVE SPORGENTI AL 5’ IN ESTREMITÀ PIATTE, SINTETIZZANDO LE BASI MANCANTI NEL FILAMENTO INCOMPLETO AL 5’ ESEMPIO ESTREMITÀ “STICKY” 5’ PROTUDING (ES.ECORI) LA TECNICA DEL “ FILLING IN” CONSISTE NEL “RIEMPIRE” l’ ESTREMITÀ SPORGENTE AL 5’ CON IL FRAMMENTO DI KLENOW, UNA DNA POLIMERASI I MODIFICATA PRIVA DELL’ATTIVITÀ 5’-3’ ESONUCLEASICA G C AATTC 5’P 3’OH dTTP dATP dGTP G TTAAG

3. Introduzione del vettore nelle cellule ospiti una volta avvenuta la ligasi è necessario trasferire il plasmide ricombinante nella cellula batterica dove può replicarsi per far questo è necessario rendere le cellule ospiti competenti cioè capaci di acquisire DNA estraneo.

TRASFORMAZIONE BATTERICA LE CELLULE POSSONO ESSERE RESE COMPETENTI UTILIZZANDO VARI METODI FISICI E CHIMICI: ELETTROPORAZIONE un breve impulso elettrico favorisce la formazione di pori nella membrana cellulare e il dna esogeno in tali condizioni è capace di entrare nella cellula TRATTAMENTO CON CACL2 il cloruro di calcio, agisce da chelante e “scherma” le cariche del dna. in queste condizioni il dna esogeno può entrare attraverso microfratture a livello di membrana formatesi a causa della bassa temperatura (0°c) a cui avviene il trattamento

IL PROBLEMA DELLA SELEZIONE 4. Identificazione delle cellule che contengono la molecola ricombinante. IL PROBLEMA DELLA SELEZIONE La trasformazione produce tre tipi di batteri, che bisogna riuscire a discriminare, nel modo più rapido e semplice possibile. BATTERI VUOTI BATTERI CONTENENTI IL SOLO VETTORE BATTERI CONTENENTI IL VETTORE LIGATO ALL'INSERTO qualunque tipo di clonaggio molecolare implica la ligasi di un inserto con un vettore e l'introduzione di questo costrutto in un ospite, generalmente, batterico. l'uso di marcatori selezionabili, per esempio resistenze ad antibiotici, permette facilmente di distinguere batteri vuoti – sensibili all'antibiotico – da batteri contenti il vettore, con o senza l'inserto, resistenti all'antibiotico.

IL PROBLEMA DELLA SELEZIONE PER SELEZIONARE LE COLONIE BATTERICHE CHE OSPITANO IL PLASMIDE RICOMBINANTE SI UTILIZZANO VARIA STRATEGIE: METODI DI INATTIVAZIONE GENICA SI TRATTA DI UN GENE CHE VIENE INATTIVATO QUANDO UN TRATTO DI DNA ESOGENO VIENE CLONATO NEL PLASMIDE. ESEMPIO 1: DOPPIA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI ESEMPIO 2: SAGGIO CROMOGENICO METODI DI SCREENING ESEMPIO 1: COLONY HYBRIDISATION ESEMPIO 2: ANALISI PER DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE ESEMPIO 3: PCR ESEMPIO 4: SEQUENZIAMENTO

IL PROBLEMA DELLA SELEZIONE ESEMPIO 1 : DOPPIA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI ESISTONO PLASMIDI CHE PRESENTANO UNA DOPPIA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI, AD ESEMPIO ALL’AMPICILLINA E ALLA TETRACICLINA. UN TRATTO DEL DNA DEL GENE CHE CODIFICA PER LA RESISTENZA ALLA TETRACICLINA COINCIDE CON IL POLYLINKER QUINDI IL VETTORE NON DIGERITO O RILIGATO SU SE STESSO, CONSENTE AI BATTERI DI CRESCERE SIA IN PRESENZA DI AMPICILLINA CHE DI TETRACICLINA. SE INVECE UN TRATTO DI DNA VIENE INSERITO IN UN SITO DEL POLYLINKER, IL GENE TCR VIENE INATTIVATO.

IL PROBLEMA DELLA SELEZIONE (INTERRUZIONE DELLA FASE DI LETTURA ) ESEMPIO 2 : SAGGIO CROMOGENICO IN ALCUNI PLASMIDI IL POLYLINKER E’ SITUATO IN UN SEGMENTO DEL GENE LAC-Z DI E.coli, CHE CODIFICA L’ENZIMA -GALATTOSIDASI IL POLYLINKER NON INTERROMPE LA FASE DI LETTURA DEL GENE LAC-Z E L’ESPRESSIONE DI QUESTO GENE NELL’OSPITE PORTA ALLA SINTESI DI -GALATTOSIDASI DOTATA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA L’ INSERIMENTO DI DNA ESOGENO, NEL POLYLINKER DEL VETTORE DI CLONAGGIO, INATTIVA LA SINTESI DI (INTERRUZIONE DELLA FASE DI LETTURA )

INDUTTORE DELLA SINTESI DELL’ ENZIMA isopropil--D-galattosidasi IPTG SAGGIO CROMOGENICO SUBSTRATO CROMOGENO DELL’ ENZIMA: 5bromo-4-cloro-3-indolil--D-galattoside X-GAL INDUTTORE DELLA SINTESI DELL’ ENZIMA isopropil--D-galattosidasi IPTG BATTERI CRESCIUTI SU UNA PIASTRA DI AGAR CONTENENTE X-GAL ED IPTG PRODUCONO -GALATTOSIDASI  LA DEMOLIZIONE DI X-GAL PRODUCE UN COMPOSTO BLU INSOLUBILE CHE RENDE LE COLONIE COLORATE

Utilizzo di LacZ per identificare i batteri ricombinanti

COLONY HYBRIDISATION

Analisi DNA clonato. Separazione di frammenti di DNA per elettroforesi su gel Analisi di frammenti di DNA clonati in plasmide per digestione ed elettroforesi

La reazione a catena della polimerasi (PCR) Amplificazione esponenziale in vitro di un frammento di DNA a sequenza nota Copie di DNA prodotte= 2n Da una singola molecola dopo 30 cicli >109 molecole

Analisi DNA clonato. Sequenziamento (F. Sanger)

Chromosome walking Clonaggio di frammenti di DNA parzialmente sovrapposti