Cellule Staminali e Terapia Rigenerativa Dipartimento di medicina Sperimentale e Clinica Università degli Studi di Firenze Cellule Staminali e Terapia Rigenerativa Francesco Liotta Liceo Scientifico Niccolò Rodolico, Firenze, 5 Febbraio 2014

Cellula Staminale (CS): definizione Cellula non specializzata in grado di “autorinnovarsi” e di generare cellule figlie capaci di differenziarsi verso tipi cellulari specializzati  La CS potenzialmente è in grado di ripopolare funzionalmente un tessuto leso

come promessa per la medicina rigenerativa La cellula staminale come promessa per la medicina rigenerativa

Cellula Staminale (CS): Due caratteristiche fondamentali Autorinnovamento Capacità differenziativa

Autorinnovamento (self-renewal) La CS è in grado di sopravvivere in un organismo in modo virtualmente illimitato sostenendo divisioni con finalità di AUTORINNOVAMENTO (self-renewal). Questa caratteristica è di fondamentale importanza per il mantenimento in un organismo del pool di cellule staminali. Cell Nutrice Cell figlia Proliferazione e differenziamento delle cellule figlie Cell figlia CS Cell Nutrice Concetto di Nicchia Staminale e di divisione asimmetrica

Capacità differenziativa Per differenziazione si intende l’acquisizione da parte di una cellula non differenziata di caratteristiche morfologiche, fenotipiche e funzionali che appartengono specificamente ad un tipo cellulare specializzato.

Differenza tra CS e progenitore cellulare <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<

Capacità differenziativa della CS Totipotente: la CS può generare cellule di ogni tipo compresa la placenta e gli annessi embrionali  generazione di un nuovo individuo Pluripotente: Singola cellula in grado di dare origine a cellule specializzate di tutti i tessuti Multipotente: produzione di cellule specializzate diverse ma tutte appartenenti ad un unico tessuto (il tessuto di appartenenza della CS) Unipotente: La CS può differenziarsi in elementi cellulari di un unico tipo

Cellule Staminali totipotenti e cellule staminali pluripotenti: Cellule Staminali Embrionali

LA FORMAZIONE DELLO ZIGOTE Oocita dopo l’ovulazione: seconda divisione meiotica Penetrazione dello spermatozoo nell’oocita Duplicazione del corredo genetico (aploide) dei due pronuclei D, E, F) Prima mitosi

SEGMENTAZIONE DELLO ZIGOTE (DIVISIONI MITOTICHE) BLASTOMERO Stadio < 8 cellule: cellula staminale TOTIPOTENTE (cellula in grado di riprodursi in modo virtualmente illimitato e di dare origine ad un individuo) Stadio > 8 cellule: le cellule della massa interna sono staminali PLURIPOTENTI (in grado di riprodursi in modo virtualmente illimitato e di dare origine a tutti i tessuti di un individuo)

LA COMPATTAZIONE DELLO ZIGOTE QUANDO LO ZIGOTE HA RAGGIUNTO LO STATO AD 8 CELLULE (A) HA INZIO LA COMPATTAZIONE (B): ACQUISIZIONE DI GIUNZIONI SERRATE TRA I BLASTOMERI. DALLA SUCCESSVA DIVISIONE CELLULARE SI GENERA LA MORULA (16 CELLULE). LE CELLULE INTERNE DELLA MORULA DARANNO ORIGINE AI TESSUTI DELL’EMBRIONE, MENTRE QUELLE ESTERNE DARANNO ORIGINE AL TROFOBLASTO E SUCCESSIVAMENTE ALLA PLACENTA

Cellule Staminali multipotenti: Cellule Staminali dei tessuti adulti Ogni tessuto possiede un patrimonio di cellule staminali deputate al mantenimento e alla rigenerazione tessutale.

Cellule staminali emopoietiche Cellula CD34+CD133+

Cellule staminali della cute Le cellule staminali dell'epidermide sono responsabili del rinnovamento giornaliero dei vari strati dell’epidermide, risiedono nello strato basale dell’epidermide. Le cellule staminali del follicolo pilifero assicurano il costante rinnovamento dei peli. Possono anche rigenerare l’epidermide e le ghiandole sebacee nel caso questi ultimi vengano danneggiati. Si trovano in varie parti del follicolo pilifero.  Le cellule staminali dei melanociti sono responsabili della rigenerazione dei melanociti, un tipo di cellula pigmentata. I melanociti producono la melanina e di conseguenza hanno un ruolo importante nella pigmentazione della pelle e dei peli. La precisa posizione di queste cellule nell'uomo non è ancora stata stabilita.

Concetto di plasticità della Cellula staminale multipotente (CS dell’adulto): La singola cellula staminale è in grado di dare origine unicamente a cellule dello stesso tessuto (vecchio dogma) La singola cellula in grado di dare origine sia a cellule dello stesso tessuto che a cellule di altri tessuti (nuovo dogma) La cellula staminale di un tessuto può differenziare in cellule di altri tessuti? Alcuni tessuti possiedono un pool eterogeneo di CS con potenziale differenziativo vario?

dedifferenziazione delle cellule tessutali Cambell KH. et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380: 64-66, 1996 Cellula somatica (di ghiandola Mammaria) di pecora Nucleo ? Cellula uovo non fecondata Dolly Nucleo Eliminazione

Cellule staminali embrionali vs cellule staminali dell’adulto Pro: - pluripotenti - crescono in maniera pressochè illimitata Contra: - possono causare rigetto del trapianto (eterologhe) - possono causare sviluppo di neoplasie (teratocarcinomi) - problematiche etiche ad esse correlate Cellule staminali da tessuti adulti: Pro: - facile reperibilità - utilizzo in autologo (assenza di problemi legati al rigetto) Contra: - multipotenti - poco rappresentate nei tessuti - capacità proliferativa relativamente bassa

Cellula Staminale Pluripotente Indotta IPS o IPSC -induced Pluripotent Staminal Cell- (Kazutoshi Takahashi e Shinya Yamanaka 2006) IPS: cellula staminale pluripotente ottenuta in vitro mediante la trasduzione di geni responsabili della staminalità in una cellula somatica adulta Oct-3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 Pro: possibilità di utilizzo in autologo Facilità a reperire le cellule da trasdurre Assenza di problemi etici Contra: Rischio di teratogenicità (c-Myc) Complessità tecnica per la loro induzione IPS Cellula somatica Geni

La promessa della ricerca sulle cellule staminali (drug effects on differentiated cells) (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) Le CS sotto lo stimolo di opportuni fattori differenziativi aggiunti in vitro, o rilasciati naturalmente nel microambiente tessutale in cui vengono impiantate tendono a differenziarsi nel tipo cellulare desiderato. Tuttavia maggiore è il grado di specializzazione della cellula che vogliamo ottenere e minore è la probabilità che una CS indifferenziata si specializzi con successo.

Applicazioni cliniche comprovate Parkinson’s infarct diabetes

Applicazioni Cliniche I Il trapianto di midollo osseo è un trattamento utilizzato da decenni per il ripopolamento del midollo osseo in corso di – immunodeficienze congenite - neoplasie ematologiche - altre patologie ematologiche quali le talassemie Si basa sulla somministrazione di Cellule Staminali emopoietiche (autologhe o eterologhe) dopo mieloablazione del ricevente (drug effects on differentiated cells) (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) diabetes Parkinson’s

Applicazioni Cliniche II Il trapianto cutaneo viene eseguito in autologo utilizzando cellule dello strato basale della cute (staminali cutanee) che vengono coltivate in vtiro a costituire un multistrato cellulare da applicare sulla parte lesa. Trattamento effettuato solo in pochi centri altamente specializzati. Il nuovo innesto cutaneo sarà privo di annessi cutanei. (drug effects on differentiated cells) (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) Applicazione su ampie zone prive di cute (grandi ustioni …) Parkinson’s infarct diabetes

Applicazioni Cliniche III Limbus (drug effects on differentiated cells) (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) Cellule staminali e trapianto di cornea: Il trapianto di cornea si basa sull’innesto di una corna eterologa che viene riepitelizzata dopo l’innesto grazie alle cellule staminali del ricevente. Se tali cellule sono morte (infezioni, malattie autoimmuni….) prima di eseguire il trapianto di cornea è necessario ripopolare il limbus con cellule staminali corneali (autologhe o eterologhe) Parkinson’s infarct diabetes

Applicazioni cliniche sperimentali Parkinson’s infarct diabetes

Applicazioni Cliniche sperimentali I: CS e infarto miocardico acuto Occlusione di un vaso coronarico Nelle prime ore dopo l’infarto miocardico acuto è possibile iniettare CS che differenziandosi a livello del tessuto in cardiomiociti, o favorendo la differenziazione in tal senso di precursori sataminali già presenti nel tessuto, possono ripopolare funzionalmente la sede di necrosi, riducendo al minimo la formazione della cicatrice fibrosa (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) Necrosi del tessuto miocardcio a valle del vaso Parkinson’s infarct diabetes

CS e infarto miocardico acuto Current strategies of stem cell application to the heart: intracoronary infusion, transendocardial, and epicardial intramyocardial injection. Staminali emopoietiche Stamiali mesenchimali ….

Cellule Staminali mesenchimali (MSCs) Adipose tissue Bone marrow PBMC Umbilical cord and fetal tissues - Frequency in BM: 0.01-0.001% - Associated molecules: CD105, CD73, CD29, CD44, CD90, CD106, HLA I low adipocytes chondrocytes osteocytes neurons skeletal muscle

Criteri essenziali per la definizione di MSCs Plastic-adherent under standard culture conditions Positive for the expression of CD105, CD73, CD90 and negative for the expression for CD34, CD45, CD11a, and HLA-DR Under specific stimuli cells differentiate into osteocytes, adipocytes, and chondrocytes in vitro (International Society for Cellular Therapy 2005)

Applicazioni Cliniche sperimentali II: CS e ischemia critica degli arti inferiori (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) Vari studi clinici riportano l’utilizzo di precursori endoteliali (sottopopolazioni di CS emopoietiche, di monociti…) nel trattamento dell’ischemia grave a livello degli arti inferiori. La riportata è quella di favorire la formazione di circoli vascolari collaterali Parkinson’s infarct diabetes

Applicazioni Cliniche sperimentali III: CS nelle malattie neurologiche … Previously, tissues of striatum and substantia nigra richly containing dopaminergic neurons were obtained from human fetal brain and were implanted into the striatum of Parkinson’s disease patients. As a result, symptoms of a part of Parkinson’s patients dramatically improved. However, these clinical trials were stopped due to the difficulty of obtaining fetal brain tissue and a great ethical problem in using an abortion fetus. (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) Kanno H. Regenerative therapy for neuronal diseases with transplantation of somatic stem cells. World J Stem Cells. 2013 Oct 26;5(4):163-171 Parkinson’s infarct diabetes

CS e loro differenziamento in cellule neuronali (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) N.B: L’acquisizione di marcatori neuronali in modelli in vitro, non implica una differenziazione in neurononi funzionalmente attivi Parkinson’s infarct diabetes

Applicazioni Cliniche sperimentali III: CS malattie neuronali (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) Al momento solo tre tipi di CS sono state utilizzate in studi clinici per il trattamento delle malattie neurologiche Parkinson’s infarct diabetes

Percorso della Ricerca Scientifica OSSERVAZIONE DEL FENOMENO FORMULAZIONE DELL’IPOTESI REALIZZAZIONE DI UN MODELLO SPERIMENTALE PER VALIDARE O CONFUTARE L’IPOTESI VALUTAZIONE DEI RISULTATI DA PARTE DELLA COMUNITA’ SCIENTIFICA PUBBLICAZIONE DEI RISULTATI RIPETIBILITA’ DEL DATO DA PARTE DI ALTRI GRUPPI DI RICERCA Parkinson’s infarct diabetes

Percorso della validazione di una “farmaco” Valutazione degli effetti del farmaco in modelli in vitro Valutazione degli effetti indesiderati e degli effetti favorevoli del farmaco in modelli in vivo (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) FASE I, APPROVAZIONE COMITATO ETICO Valutazione degli effetti indesiderati del farmaco nell’uomo su piccole coorti di soggetti sani volontari contro placebo (n 20 – 80) Valutazione degli effetti indesiderati e degli effetti favorevoli in pazienti rispetto al placebo o a farmaci gia’ comprovati su casistiche piu’ ampie (n = 20 – 300) FASE II, APPROVAZIONE COMITATO ETICO Valutazione degli effetti indesiderati e degli effetti favorevoli Nell’uomo rispetto al placebo o a farmaci gia’ comprovati su casistiche molto ampie (300 – 3000) FASE III, APPROVAZIONE COMITATO ETICO Parkinson’s infarct diabetes

Regolamentazione in Italia In Italia, dopo l’emanazione della l. 19 febbr. 2004 n. 40 e il risultato del referendum del 12 e 13 giugno 2005, che riguardava anche l’utilizzo delle cellule staminali embrionali nella ricerca, la posizione è chiara: le sperimentazioni delle terapie cellulari possono avvalersi soltanto del recupero di staminali adulte, cordonali ed embrionali unicamente se derivate da embrioni prodotti in soprannumero durante le procedure di fertilizzazione in vitro nelle cure contro l’infertilità. È, invece, illegale derivare nuove linee di cellule staminali embrionali (l. n. 40). Le ragioni di tale scelta, che sono insieme etiche e scientifiche, riguardano l’assoluta intangibilità dell’embrione umano sin dalla fecondazione, il divieto di sopprimere embrioni umani al fine di ricavarne cellule staminali embrionali e l’inefficacia riguardo alla loro potenziale utilità nella cura di condizioni attualmente incurabili. Per questo la possibilità di lavorare legalmente in Italia sulle linee ES è resa del tutto vana dalle politiche di finanziamento pubblico: l’Italia, insieme a Germania, Austria, Polonia, Slovacchia e Malta, ha dichiarato in sede europea di non poter «accettare che attività comportanti la distruzione di embrioni umani possano beneficiare di un finanziamento a titolo del settimo programma quadro di ricerca». I sei Paesi si sono uniti nella soluzione di rafforzare la ricerca sulle cellule staminali adulte per evitare di finanziare attività di ricerca sulle cellule staminali umane embrionali, auspicando incentivi al solo campo di ricerca delle staminali adulte (http://www.camera.it/parlam/leggi/04040l.htm). (mechanisms of embryogenesis control of gene expression) Parkinson’s infarct diabetes