TRADUZIONE La sintesi proteica è quel processo in cui il linguaggio dei nucleotidi viene TRADOTTO nel linguaggio degli aminoacidi che compongono le proteine Questa lezione è dedicata a studenti ……bla bla Questa è la prima di un ciclo di lezioni dedicate alla sintesi delle proteine. In questa lezione affronteremo quelli che sono i meccanismi generali della sintesi delle proteine in procarioti ed eucarioti, almeno un’altra lezione dovrà essere dedicata agli aspetti regolativi del processo

LA TRADUZIONE = SINTESI PROTEICA ??? Il tRNA converte il “linguaggio” dei nucleotidi in quello degli aminoacidi + aminoacil tRNA sintetasi = TRADUZIONE …………..+ RIBOSOMA = SINTESI PROTEICA

contiene l’informazione codificata nel genoma Gli RNA della sintesi proteica RNA Messaggero (mRNA) contiene l’informazione codificata nel genoma RNA di Trasporto (tRNA) L’ adattatore converte il “linguaggio” dei nucleotidi in quello degli aminoacidi RNA Ribosomale (rRNA) funzione strutturale e catalitica L’mRNA ha una sequenza in basi che codifica una proteina Gli RNA della sintesi proteica sono di tre tipi ovviamente abbiamo bisogno dell’RNA messaggero che contiene l’informazione codificata nel genoma che dovrà essere poi tradotta in una sequenza di aa poi abbiamo bisogno dei tRNA che sono dei piccoli rna che come vedremo hanno una funzione di adattatori e hanno una struttura tridimensionale molto specifica Poi abbiamo bisogno degli RNA ribosomali, RNA che partecipano alla composizione del ribosoma, questa grande struttura costituita da questi RNA molto strutturati , molto ripiegati su se stessi con delle regioni a struttura secondaria molto conservata e che come vedremo hanno una funzione catalitica molto importante struttura che viene coadiuvata nella sua funzione da diverse proteine

proteine concatenando gli aminoacidi portati dai tRNA. LA TRADUZIONE Ogni amminoacido è specificato da un codone (tre nucleotidi) nell’mRNA secondo un codice universale I tRNA fungono da adattatori che caricano, ad opera di una specifica aminoacil-tRNA sintetasi, l’aminoacido corrispondente al codone da essi riconosciuto sull’mRNA. Il ribosoma, un grande complesso ribonucleoproteico realizza la sintesi delle proteine concatenando gli aminoacidi portati dai tRNA.

Codice genetico INSIEME DELLE REGOLE CHE COLLEGANO LA SEQUENZA DI BASI DEL DNA ALLA SEQUENZA DEGLI AMINOACIDI DELLE PROTEINE. Linguaggio molecolare è basato sull’ordine in cui si susseguono nella molecola di DNA le 4 diverse basi azotate La traduzione dell’informazione genetica richiede il passaggio da un alfabeto di 4 lettere (nucleotidi) ad un alfabeto di 20 lettere (amminoacidi), ne consegue che ogni aminoacido deve essere codificato da più di una base

Codice genetico La successione di 3 basi fornisce 64 (43)combinazioni, numero largamente sufficiente a determinare i 20 aminoacidi presenti nella cellula. Il codice genetico è formato da triplette di basi nucleotidiche (parole di 3 lettere) Ogni sequenza di tre basi nucleotidiche (codone) specifica un particolare aminoacido. Il codice genetico mette in relazione i codoni con i singoli aminoacidi.

Codice genetico Il codice è degenerato. Delle 64 triplette (codoni) Il codice genetico assegna a ciascuna delle 64 possibili triplette uno specifico significato utilizzando le molecole di tRNA come adattatori Delle 64 triplette (codoni) 3 triplette sono codoni di stop segnali di fine lettura (UGA, UAA, e UAG) 1 tripletta (AUG) costituisce il segnale di inizio. I 64 codoni sono in eccesso rispetto agli aminoacidi da codificare uno stesso aminoacido è codificato da più di un codone. Solo Met e Trp sono specificati da un solo codone Il codice è degenerato.

Codice genetico caratteristiche È a triplette non ha sovrapposizioni. L’mRNA viene letto in maniera continua in gruppi successivi di 3 nucleotidi senza saltare alcun nucleotide del messaggio. Ha segnali di inizio e fine È degenerato Il codice genetico è universale

IL CODICE GENETICO leu phe ser In un codice non sovrapposto formato da triplette di nucleotidi tutti gli mRNA hanno tre potenziali quadri di lettura. Le triplette, e quindi gli a.a. codificati, sono molto diversi in ciascun quadro di lettura La porzione di mRNA che codifica per una proteina è detta ORF (open reading frame), ed è costituita da una serie di triplette che inizia con una tripletta di inizio e termina con una tripletta di stop. ORF

mRNA, 2) tRNA; 3) aminoacil-tRNA sintetasi; 4) ribosoma. Sintesi proteica Il macchinario responsabile della traduzione è tra i più conservati nel corso dell’evoluzione ed è composto da 4 componenti principali: mRNA, 2) tRNA; 3) aminoacil-tRNA sintetasi; 4) ribosoma. Gli mRNA vengono letti in direzione 5’- 3’ La proteina viene prodotta dall’N terminale al C terminale.

Gli mRNA eucariotici (b) contengono un solo ORF (monocistronici). mRNA procariotici ed eucariotici. Gli mRNA procariotici (a) normalmente contengono più ORF e per questo vengono detti policistronici. Gli mRNA eucariotici (b) contengono un solo ORF (monocistronici).

I tRNA assumono una struttura 3D simile ad una L rovesciata. La struttura dei tRNA La traduzione è resa possibile dai tRNA che fungono da adattatori tra i codoni e gli amino acidi. I tRNA hanno una struttura conservata e una lunghezza compresa tra 75 e 95 nt. I tRNA contengono basi insolite, prodotte da modificazioni enzimatiche post-trascrizionali. I tRNA assumono una struttura 3D simile ad una L rovesciata.

La formazione dell’amminoacil-tRNA avviene ad opera delle tRNA sintetasi Le molecole di tRNA cui è attaccato un a.a. sono dette cariche I tRNA vengono caricati per mezzo di un a.a. che si lega all’adenosina dell’estremità 3’ tramite un legame acilico ad alta energia adenilazione dell’amminoacido: l’a.a. reagisce con l’ATP diventa adenilato e si libera il pirofosfato (si lega AMP) 2) Caricamento del tRNA: trasferimento dell’a.a. adenilato al 3’ del tRNA e formazione di un legame estereo. (si rilascia AMP)

Le tRNA sintetasi riconoscono le caratteristiche strutturali esclusive dei rispettivi tRNA Ogni amminoacil-tRNA sintetasi è specifica per un solo amminoacido (20 aaTS), ma può caricare più tRNA (isoaccettori). La specificità di riconoscimento dei tRNA isoaccettori è determinata dall’ansa dell’anticodone (ma più anticodoni possono corrispondere allo stesso amminoacido) e dalla base discriminante sul braccio accettore. Base discriminante Secondo codice genetico

Formazione dell’amminoacil-tRNA La frequenza di errori nel caricamento è molto bassa (<0,01 %) e dipende dalla specificità del riconoscimento dell’amminoacido. b) dall’intervento di un sistema di correzione che idrolizza i complessi aa-AMP non specifici.

Formazione dell’amminoacil-tRNA La frequenza di errori nel caricamento è molto bassa (<0,01 %) e dipende dalla specificità del riconoscimento dell’amminoacido. b) dall’intervento di un sistema di correzione che idrolizza i complessi aa-AMP non specifici. idrofilico idrofobico a.a. di dimensioni, forme e gruppi chimici differenti : Cisteina e Triptofano facile distinzione a.a. simili :Tirosina e Fenilalanina la presenza del gruppo idrossilico della tirosina permette la formazione di un legame idrogeno forte ed energeticamente favorevole con l’enzima

Gli AMP-a.a.piccoli come la valina entrano nel sito e sono idrolizzati Formazione dell’amminoacil-tRNA La frequenza di errori nel caricamento è molto bassa (<0,01 %) e dipende dalla specificità del riconoscimento dell’amminoacido. b) dall’intervento di un sistema di correzione che idrolizza i complessi aa-AMP non specifici. La presenza del gruppo metilico dell’Isoleucina non permette alla valil-tRNA-sintetasi di legare l’isoleucina perché il CH3 crea ingombro sterico MA La valina potrebbe entrare nel sito catalitico della isoleucil-tRNA-sintetasi CORREZIONE Sito di correzione nell’enzima: Gli AMP-a.a.piccoli come la valina entrano nel sito e sono idrolizzati Gli AMP-a.a.-grandi come la isoleucina non riescono ad entrare nel sito del sistema di correzione idrofobico

giusta interazione codone –anticodone IL RIBOSOMA NON È IN GRADO DI DISTINGUERE TRA tRNA CARICATI IN MODO CORRETTO O SBAGLIATO Il ribosoma controlla solo l’appropriata interazione codone-anticodone ma non è in grado di distinguere tRNA caricati in modo non corretto. Il ribosoma accetta a “scatola chiusa” qualsiasi tRNA carico Il ribosoma controlla solo la giusta interazione codone –anticodone che esso porti o meno l’a.a. corretto Il ribosoma accetta l’a.a. modificato

IL RIBOSOMA Il ribosoma è l’apparato macromolecolare che dirige la sintesi proteica. E’ costituito da almeno 3 molecole di RNA e oltre 50 proteine. Il ribosoma è costituito da due subunità, che si associano in modo reversibile. La subunità maggiore è responsabile dell’attività catalitica (peptidil-transferasica) La subunità minore è deputata alla decifrazione dei codoni sull’mRNA. Le componenti del ribosoma sono denominate in base alla loro velocità di sedimentazione in ultracentrifuga.

IL CICLO DEL RIBOSOMA La subunità maggiore e minore si associano e dissociano ad ogni ciclo di traduzione.

IL POLISOMA Ciascun mRNA può essere tradotto simultaneamente da più ribosomi . Un mRNA associato a più ribosomi viene detto polisoma (o poliribosoma). Questo fa sì che nonostante gli mRNA non rappresentino più del 5% dell’RNA totale in una cellula, la maggior parte dei ribosomi sia impegnata nella traduzione (una cellula di E.coli contiene circa 15.000 ribosomi).

La cavità tra le subunità è il sito di legame x il tRNA Risoluzione della struttura 3D del ribosoma procariotico Le componenti a RNA costituiscono il core del ribosoma e sono responsabili delle sue funzioni chiave. Le proteine ribosomiali si trovano ai margini e servono prevalentemente a stabilizzare gli rRNA altamente addensati e ricchi di cariche negative. La cavità tra le subunità è il sito di legame x il tRNA L’RNA della subunità 50S è colorata in grigio La componente proteica della subunità 50S è colorata in violetto L’RNA della subunità 30S è colorata in azzurro La componente proteica della subunità 30S è colorata in blu

formazione del legame peptidico. Il ribosoma catalizza una sola reazione chimica formazione del legame peptidico. Questo avviene mediante il trasferimento della catena polipeptidica nascente da un tRNA all’altro. La formazione del legame peptidico non richiede energia. Utilizza l’energia rilasciata dalla rottura del legame estereo

Il ribosoma ha tre siti di legame per il tRNA La reazione peptidil-transferasica richiede la presenza contemporanea di almeno due tRNA sul ribosoma. Il ribosoma contiene tre siti di legame per i tRNA: il sito A è il sito di legame per l’aminoacil-tRNA; il sito P lega il peptidil-tRNA; il sito E (exit) lega il tRNA che viene rilasciato in seguito alla formazione del legame peptidico. I tre siti sono localizzati all’interfaccia tra la subunità maggiore e la subunità minore. Ia formazione del legame peptidico è reso possibile dal fatto che il peptidil-tRNA e l’aminoacil-tRNA sono posizionati uno vicino all’altro nel ribosoma.

Inizio della traduzione L’inizio della traduzione richiede che: 1) il ribosoma si associ all’ mRNA; 2) un tRNA carico si posizioni nel sito P; 3) il ribosoma sia posizionato correttamente sul sito di inizio. L’esatto posizionamento del ribosoma sul codone di inizio è cruciale fissa la corretta lettura x la traduzione (reading frame)

Inizio della traduzione nei procarioti SEQUENZE SHINE- DALGARNO

Successivamente si ha l’associazione della subunità maggiore. Inizio della traduzione nei procarioti Gli mRNA procariotici vengono reclutati dalla subunità minore tramite appaiamento di basi con l’RNA 16S Il legame dell’rRNA 16S con la sequenza SD posiziona il codone iniziatore sul sito P. Successivamente si ha l’associazione della subunità maggiore. SEQUENZA SHINE- DALGARNO

Il tRNA iniziatore: fMet-tRNA Normalmente i tRNA carichi entrano nel sito A. Solo il tRNA iniziatore entra direttamente nel sito P. Il tRNA iniziatore (tRNAi fMet ) riconosce il codone AUG (o GUG) ed è caricato con una metionina formilata. Normalmente, il gruppo formile viene poi rimosso dall’enzima deformilasi.

I fattori di inizio della traduzione L’inizio della traduzione richiede tre fattori di inizio: IF1, IF2 e IF3. IF1 impedisce il legame di altri tRNA al sito A IF2 (GTPasi) facilita l’associazione del tRNA iniziatore al sito P IF3 si lega in corrispondenza del sito E e previene l’associazione della subunità maggiore del ribosoma

Si legano i tre fattori di inizio In seguito al legame dei tre fattori di inizio la subunità minore lega l’RNA e il tRNA iniziatore in ordine casuale.

abbandona il ribosoma insieme a IF1. mRNA e tRNA iniziatore correttamente posizionati, rilascio di IF3, e associazione della subunità maggiore Il legame della subunità maggiore stimola l’attività GTPasica di IF2 che si trasforma in IF2•GDP, e abbandona il ribosoma insieme a IF1. Si forma in questo modo il ribosoma integro (70S) dove il sito A è ora accessibile ai tRNA carichi.

Inizio della traduzione negli eucarioti Tale processo richiede molti fattori proteici (più di 30) compresi quelli omologhi a quelli già descritti nei procarioti. Il cambiamento più rilevante riguarda la modalità di riconoscimento dell’ mRNA e del codone iniziatore. I ribosomi eucariotici vengono reclutati sull’ mRNA dal Cap al 5’

Si forma il complesso di pre-inizio 43S. Si legano i primi due fattori Il tRNA iniziatore, carico con Metionina, si lega alla subunità minore prima dell’mRNA. Si forma il complesso di pre-inizio 43S. complesso di pre-inizio 43S.

Il riconoscimento dell’mRNA in eucarioti è mediato dal fattore eIF4 4E lega il Cap 4G lega Cap e 4E 4A attività elicasica 4B attiva 4A 4E lega il Cap 4G lega Cap e 4E 4A attività elicasica 4B attiva 4A Legame specifico cap e subunità E Il legame di 4B attiva l’attività elicasica della subunità A

(il primo AUG che incontra) . mRNA scanning Il complesso 43S si lega al cap dell’mRNA e scorre lungo l’mRNA sino a quando non trova il codone iniziatore (il primo AUG che incontra) . Lo scanning dell’mRNA, che utilizza l’energia fornita dall’idrolisi di ATP, termina quando il tRNA iniziatore si posiziona correttamente in corrispondenza del codone di inizio.

mRNA scanning Si associa la subunità maggiore. Si forma il complesso di pre-inizio 80S dove: il tRNA Met è correttamente posizionato nel sito P il sito A è libero, e può accogliere gli altri tRNA carichi per proseguire la traduzione.

Circolarizzazione polyA-dipendente dell’mRNA L’interazione tra la polyA-binding protein e la subunità G di eIF4 mantiene l’mRNA in una conformazione circolare che aumenta l’efficienza della traduzione. Il ribosoma appena rilasciato si trova nella posizione ideale x ricominciare

Si forma il legame peptidico La fase di allungamento Il meccanismo di allungamento è estremamente conservato tra procarioti ed eucarioti. l’inserimento del corretto tRNA carico nel sito A ad opera del fattore EF-Tu legato a GTP; formazione del legame peptidico tra l’amminoacido (sito A) e il peptide (sito P) ad opera della peptidiltransferasi Si forma il legame peptidico

Traslocazione Una volta formato un nuovo legame peptidico deve aver luogo la traslocazione nella quale: a) il tRNA deacilato deve spostarsi nel sito E b) il peptidil-tRNA deve spostarsi dal sito A al sito P c) l’mRNA deve spostarsi di tre nucleotidi per esporre il successivo codone.

Termine della traduzione La traduzione termina quando uno dei tre codoni di stop entra nel sito A del ribosoma. I codoni di stop vengono riconosciuti da proteine dette fattori di rilascio (RF, releasing factors) che determinano il rilascio della catena polipeptidica. I fattori di classe I riconoscono i codoni di stop e innescano l’idrolisi della catena polipeptidica. I fattori di classe II (regolati da GTP) stimolano la dissociazione dei fattori di classe I dal ribosoma. Classe I Procarioti: RF1 (UAG, UAA), RF2 (UGA) Eucarioti: eRF1 (UAG, UAA, UGA) Classe II Procarioti: RF3 Eucarioti: eRF3

I fattori di classe I riconoscono i codoni di stop e innescano il rilascio della catena polipeptidica Motivo GGQ (glicina glicina glutammina) Presente in tutti gli RF1 Situato in prossimità del centro peptidil transferasico E’ coinvolto direttamente nel rilascio del polipeptide???? tRNA rosso RF1 grigio

La regolazione della traduzione Porta ad una più veloce variazione dei livelli di proteina Vantaggio : risposta immediata agli stimoli esterni senza passare per la regolazione trascrizionale Agisce a livello dell’inizio

Inibizione del riconoscimento dell’RBS Il legame di una proteina vicino all’RBS ne impedisce l’accesso all’ rRNA 16S e quindi il legame della subunità piccola Appaiamento intramolecolare dell’mRNA Mascheramento dell’RBS delle ORFs dell’operone Il passaggio del ribosoma sull’ORF 1 distrugge l’appaiamento

Le proteine ribosomali sono repressori traduzionali della propria sintesi Per ciascun operone ribosomale una delle proteine da esso codificata è in grado di legare il messaggero di quell’operone vicino all’RBS del gene più vicino al 5’ inibendo la trascrizione dell’operone stesso

Le proteine ribosomali sono repressori traduzionali della propria sintesi b quando non c’è rRNA libero la proteina ribosomale regolatice si lega vicino all’RBS del gene della proteina 1 inibendo la trascrizione di questa ORF. Se non c’è traduzione della proteina ribosomale 1 si ha appaiamento intramolecolare dell’mRNA e mascheramento dell’RBS delle ORFs dell’operone a quando c’è rRNA libero le proteine ribosomali espresse dall’operone si legano all’rRNA favorendo la giusta formazione del ribosoma

I fattori di inizio della traduzione L’inizio della traduzione richiede tre fattori di inizio: IF1, IF2 e IF3. IF1 impedisce il legame di altri tRNA al sito A IF2 (GTPasi) facilita l’associazione del tRNA iniziatore al sito P IF3 si lega in corrispondenza del sito E e previene l’associazione della subunità maggiore del ribosoma

Regolazione della traduzione in eucarioti In condizioni di stress la cellula eucariotica diminuisce globalmente la traduzione il riconoscimento dell’mRNA il legame del tRNA iniziatore al ribosoma Meccanismo di inibizione: Fosforilazione di elF2 IF2 (GTPasi) facilita l’associazione del tRNA iniziatore al sito P elF2 + GTP tRNA + sito P della subunità 40 S elF2pp + GTP tRNA + sito P della subunità 40 S Le chinasi di elF2 sono attivate da molte differenti condizioni cellulari mancanza di aa, alte temp, infezione virale ……….. L’inizio della traduzione eucariotica è regolato da proteine che agiscono sui fattori indispensabili per : L’inibizione di uno qualsiasi dei due sopprime la nuova sintesi proteica

L’inizio della traduzione eucariotica è regolato dalle proteine che legano eIF4 m 4E lega il Cap 4G lega Cap e 4E 4A attività elicasica 4B attiva 4A

L’inizio della traduzione eucariotica è regolato dalle proteine che legano eIF4

L’inizio della traduzione eucariotica è regolato dalle proteine che legano eIF4E

Le 4E-BP specifiche controllano l’inizio della traduzione Regolazione della traduzione di OSKAR 2 proteine inibiscono la traduzione di OSKAR : Cup (una specifica 4E-BP) e BRUNO Bruno si lega al mRNA di Oskar nella regione 3’ non tradotta Cup lega BRUNO

Il ferro regola la traduzione della ferritina 4A attività elicasica 4B attiva 4A IRE= iron regulatory element IRP= iron regulatory protein

Le cellule Eucariotiche degradano gli mRNA incompleti (codoni nonsenso)

Le cellule Eucariotiche degradano gli mRNA dotati di codoni di stop prematuri (codoni non stop)