Compartimentazione cellulare

Schema ipotetico delle origini del nucleo

Schema ipotetico delle origini del mitocondrio Figure 12-4b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Le proteine possono muoversi fra i compartimenti in modi diversi La sintesi delle proteine inizia sui ribosomi nel citosol. Esse saranno destinate ad un determinato compartimento in base ad un segnale di smistamento contenuto nella loro sequenza amminoacidica. Esistono tre tipi di trasporto: Trasporto regolato (pori nucleari) Trasporto transmembrana (ad opera di proteine traslocatrici) Trasporto vescicolare

Trasporto vescicolare Le vescicole gemmano da un compartimento donatore e si fondono con un compartimento bersaglio riversando il contenuto proteico al loro interno

La maggior parte dei segnali di smistamento si trova in un tratto ben definito di sequenza amminoacidica, generamente lungo dai 15-60 aa. Le sequenze segnale possono travarsi all’ammino-terminale, al carbossi-terminale oppure interne alle proteine Zona segnale-Sequenza segnale tridimensionale Le sequenze segnale condividono stesse proprietà chimico-fisiche

Trasporto di molecole fra il nucleo ed il citosol

Due membrane concentriche penetrate da complessi di pori nucleari La membrana nucleare interna contiene proteine di aggancio per la cromatina e per le proteine della lamina nucleare che fornisce il supporto strutturale La membrana nucleare esterna è in continuità la membrana dell’ER L’involucro nucleare è perforato dai complessi dei pori nucleari (NPC)

I complessi NPC sono costituiti da proteine chiamate nucleoporine Per diffusione passiva passano attraverso il poro piccole molecole con un peso molecolare inferiore ai 5000 dalton La velocità di diffusione passiva dipende dalla dimensione della molecola

Molecole di grosse dimensioni possono entrare nel nucleo solo per trasporto attivo

Funzione del segnale di localizzazione nucleare I segnali consistono di una o due sequenze ricche di amminoacidi carichi positivamente Le proteine possono attraversare il poro nucleare anche se “foldate”

I segnali di localizzazione nucleare vengono riconosciuti da delle proteine chiamate Importine Le Importine legano sia i segnali di localizzazione che le nucleoporine Importine diverse legano segnali di localizzazione diverse L’esporto nucleare funziona allo stesso modo dell’importo nucleare ma alla rovescia. I recettori di trasporto nucleare, si chiamano Esportine

RAN-GAP (proteina che attiva la GTPasi) nel citosol La GTPasi RAN è essenziale per il trasporto attivo attraverso i pori nucleari RAN-GAP (proteina che attiva la GTPasi) nel citosol RAN-GEF (scambiatore guanilico) nel nucleo

Esempio di importo nucleare del fattore trascrizionale NF-AT necessario per l’attivazione delle cellule

Meccanismi di trasporto dal citosol ai mitocondri

Proteine della matrice: Sequenza segnale rimossa dopo importazione Le proteine che vengono destinate al mitocondrio vengono sintetizzate come precursori nel citoplasma e poi traslocate al mitocondrio con un meccanismo post-traduzionale Proteine della matrice: Sequenza segnale rimossa dopo importazione La sequenza segnale è costituita da un’alfa-elica anfipatica con i residui carichi positivamente da un lato dell’elica

Complesso TOM sulla membrana esterna La traslocazione delle proteine attraverso le membrane mitocondriali è mediata da complessi proteici che funzionano da traslocatori Complesso TOM sulla membrana esterna 2 Complessi TIM sulla membrana interna (TIM23 e TIM22)

I precursori delle proteine mitocondriali non si ripiegano dopo la sintesi ma vengono mantenute in stato “unfolded” da chaperon moleolari come Hsp70 Il complesso TOM è necessario per l’importazione dellle proteine mitocondriali codificate dal nucleo Il complesso TOM trasporta le proteine nello spazio intermembrana e le aiuta ad inserire nella membrana esterna Le proteine B-Barrel, molto abbondanti nella membrana esterna vengono inserite nella membrana esterna con un corretto ripiegamento ad opera del complesso SAM Il complesso TIM23 è necessario per l’importazioni delle proteine nella membrana interna Il complesso OXA media l’inserzione di proteine sintetizzate dai mitocondri nella membrana interna

Importazione di una proteina nella matrice miocondriale 1) La proteina tramite la sequenza segnale si lega al complesso TOM 2) La proteina passa attraverso il complesso TOM ed arriva al complesso TIM23 3) La proteina passa attraverso il complesso TIM23, viene rilasciata nella matrice ed il peptide segnale viene rimosso dalla peptidasi del segnale

Il gradiente elettrochimico ai due lati della membrana interna è fondamentale per la traslocazione 1) Dopo il passaggio attraverso il complesso TOM il peptide segnale viene riconosciuto e legato dal complesso TIM 2) La sequenza segnale trasloca dal complesso TIM alla matrice richiede un potenziale di membrana attraverso la membrana interna 3) L’Hsp70 mitocondriale associata al complesso TIM “tira” la proteina nella matrice non appena questa fuoriesce dal complesso TIM, in modo ATP-dipendente

Integrazione delle porine (con struttura a beta-barrel) nella membrana mitocondriale esterna

Trasporto delle proteine nella membrana mitocondriale interna e nello spazio intermembrana

Importazione di proteine nella membrana mitocondriale interna (I caso) Alcune proteine posseggono un segnale di indirizzamento alla matrice e successivamente un segnale di stop del trasferimento con proprietà idrofobiche

Importazione di proteine nella membrana mitocondriale interna (II caso) Per alcune proteine codificate dal nucleo e per proteine sintetizzate dal mitocondrio

Importazione di proteine nella membrana mitocondriale interna (III caso) Alcune proteine (proteine con molti domini transmembrana) posseggono un peptide segnale interno. Queste passano prima nello spazio intermembrana attraverso TOM, vengono mantenute in uno stato non ripiegato attraverso chaperone molecolari e vengono inserite in membrana da TIM22

Importazione di proteine nello spazio intermembrana Le proteine vengono inserite prima nella membrana interna con i meccanismi precedenti e successivamente una peptidasi del segnale rimuove il peptide idrofobico, liberando la proteina nello spazio intermembrana

Meccanismi di trasporto dal citosol ai perossisomi

I perossisomi

1)Beta ossidazione degli acidi grassi I perossisomi sono importantissimi poiché in essi si verificano importanti cicli metabolici: 1)Beta ossidazione degli acidi grassi 2) Formazione dei plasmalogeni (fosfolipidi nella mielina) 3) Ciclo del gliossilato nelle piante 4) Azione detossificante nelle cellule del fegato e rene in quanto ossidano vari substrati come il fenolo, acido formico, formaldeide Le reazioni ossidative producono acqua ossigenata I perossisomi contengono altissime concentrazioni di Catalasi La catalasi utilizza l’H2O2 prodotta in queste reazioni secondo la reazione 2H2O2 H2O + O2

Il processo di importazione è ancora poco noto La tipica sequenza segnale che destina le proteine al perossisoma è la sequenza SKL al C-terminale della proteina Il processo di importazione è ancora poco noto Al processo di importazione partecipano delle proteine dette perossine. Il processo è ATP dipendente Mutazioni nel gene Pex2 determinano la sindrome di Zellweger Le cellule presentano dei perossisomi “vuoti” a causa di difetti nel processo di importazione. Tale patologia porta gravi anomalie cerebrali, nel rene e nel fegato e gli affetti muoiono poco dopo la nascita

Si pensa che i perossisomi si originano da vescicole precursori, che partono dal reticolo endoplasmatico Si pensa che queste vescicole contengono i recettori implicati nell’importazione di proteine all’interno del perossisoma Una volta che si è generato il perossisoma maturo questo si duplica per fissione

Meccanismi di trasporto di proteine dal citosol al reticolo endoplasmatico

Meccanismi di trasporto di proteine dal citosol al reticolo endoplasmatico è co-traduzionale

Il reticolo endoplasmatico è costituito da un sistma di tubuli e sacchi appiattiti interconnessi ed è continuo con la membrana nucleare esterna Il reticolo svolge differenti funzioni nella biosintesi dei lipidi e delle proteine e serve da deposito di ioni calcio La sua membrana è il sito di produzione di tutte le proteine transmembrana e di tutti i lipidi per la maggior parte degli organelli di una cellula

Nel reticolo endoplasmatico vi sono enzimi implicati nella biosintesi del colesterolo e nel processamento del colesterolo al fine di rodurre ormoni steroidei Gli epatociti sono cellule con abbondante RE che è il sito di produzione delle lipoproteine che portano i lipidi attraverso il torrente circolatorio ad altre parti del corpo Il RE svolge funzioni di detossificazione cellulare mediante enzimi della famiglia del citocromo P450 che catalizzano reazioni di solubilizzazione di sostanze tossiche insolubili che lasciano quindi la cellula e vengono escreti nell’urina Cellule muscolari hanno abbondante RE (Reticolo sarcoplasmatico) specializzato nell’accumulo e rilascio degli ioni calcio implicati rispettivamente nella rilassamento e contrazione delle miofibrille

Ipotesi del peptide segnale

Il peptide segnale è riconosciuto dalla proteina SRP

Meccanismo con cui le sequenze segnale dell’ER e la SRP dirigono i ribosomi alla membrana dell’ER

Ribosomi liberi ed attaccati alla membrana

E’ costituito da alfa-eliche che circondano un poro centrale Il traslocatore Sec61 E’ costituito da alfa-eliche che circondano un poro centrale Esso ha la caratteristica di aprirsi lateralmente permettendo alla sequenza segnale di diffondere nel doppio strato lipidico

Modello di traslocazione di una proteina solubile attraverso la membrana del ER

Modello di traslocazione di una proteina transmembrana a singolo passaggio attraverso la membrana del ER

Integrazione di una proteina transmembrana a singolo passaggio nella membrana dell’RE

Gli amminoacidi carichi positivamente precedono la sequenza idrofobica di stop trasferimento rispetto a quelli che lo seguono

Gli amminoacidi carichi negativamente precedono la sequenza idrofobica di stop trasferimento rispetto a quelli che lo seguono

La maggior parte delle proteine sintetizzate nell’ER sono glicosilate al livello di un gruppo amminico di un residuo di asparagina La N-glicosilazione avviene al livello dell’Asn nella sequenza Asn-X-(Ser, Thr) La N-glicosilazione consiste nell’aggiunta di un oligosaccaride precursore costituito da Glucosio, Mannosio ed N-acetilglucosammina per un totale di 14 zuccheri

L’oligosaccaride precursore è mantenuto nella membrana dell’ER da una molecola lipidica chiamata DOLICOLO FOSFATO L’oligosaccaride precursore è legato all’N dell’Asn attraverso una reazione catalizzata dall’enzima Oligosaccaril-transferasi

Sintesi del l’oligosaccaride precursore attaccato al lipide nella membrana del RE

Il ruolo della N-glicosilazione nel folding delle proteine Sistema Calnessina-Calreticulina Il sistema Calnessina-Calreticulina lavora in stretta associazione con le proteine PDI

Controllo di qualità: le proteine ripiegate non correttamente vengono retrotraslocate nel citoplasma e degradate in modo ubiquitina-dipendente Il tempo di ritenzione nel RE viene stabilito in base a lente rimozioni di mannosio ad opera di mannosidasi

UPR: Unfolded protein response Nel Golgi XBP1 ATF6 p50 (forma attiva)

ATF6 e XBP1 sono fattori trascrizionali che legano le sequenze ERSE su promotori di chaperon molecolari come BiP attivando la trascrizione di questi geni Se la situazione di stress si protrae troppo la cellulava incontro ad un arresto del ciclo cellulare e successivamente muore per apoptosi

Nel reticolo endoplasmatico avviene un ulteriore modifica post-traduzionale delle proteine: l’aggiunta di glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI) La proteina si troverà sul versante extracellulare; in seguito ad opportuni stimoli che attivano fosfolipasi di membrana la proteina può essere rilasciata nel mezzo extra-cellulare