La doppia elica del DNA agisce da stampo per la propria replicazione

Reazione di polimerizzazione del DNA catalizzata dalla DNA POLIMERASI

Sintesi di DNA catalizzata dalla DNA polimerasi

Esperimento di Meselson e Stahl La Replicazione del DNA è semiconservativa Esperimento di Meselson e Stahl Gradiente CsCl

Modelli ERRATO di replicazione del DNA L’ipotesi più semplice per la replicazione del DNA sarebbe la replicazione di un filamento in direzione 5’-3’ e la replicazione del filamento antiparallelo in direzione 3’-5’. Tale modello prevederebbe la presenza di 2 DNA polimerasi diverse (5’-3’ e 3’-5’) ma TUTTE le DNA POLIMERASI sintetizzano filamenti di DNA esclusivamente in direzione 5’-3’ !!!

Modello corretto di replicazione del DNA Mediante esperimenti di “pulse and chase” con timidina 3H, furono identificati frammenti di DNA lunghi e frammenti brevi di circa 1000-100bp (frammenti di Okazaki). I frammenti di Okazaki vengono sintetizzati in direzione 5’-3’ e successivamente vengono uniti tra di loro. Durante la replicazione del DNA i filamenti vengono sintetizzati in direzione 5’-3’; uno dei due filamenti viene sintetizzato in modo continuo (filamento veloce) mentre l’altro viene sintetizzato in modo discontinuo (filamento ritardato). Quindi la forca replicativa è asimmetrica

Fedeltà della replicazione del DNA Durante la replicazione del DNA viene compiuto 1 errore su 109 basi (processo altamente fedele) I nucleotidi male appaiati vengono eliminati ad opera dell’attività di ESONUCLEASI di CORREZIONE di BOZZE 3’-5’ L’enzima DNA polimerasi è AUTOCORREGGENTE:rimuove i propri errori di polimerizzazione mentre scorre lungo il DNA Se il primer non è perfettamente appaiato la DNA polimerasi effettua la correzione degli errori prima di procedere

La DNA polimerasi è più fedele della RNA polimerasi di 100000 volte DNA polimerasi 1 errore su 109 ; RNA polimerasi(1 errore su 104 bp)

Solo una replicazione in direzione 5’-3’ permette una correzione efficiente degli errori

L’enzima RNAsi H rimuove il primer ad RNA che viene sostituito da DNA L’enzima responsabile della formazione di questo innesco è la DNA primasi La DNA polimerasi per funzionare ha bisogno di un innesco (Primer) che fornisce un gruppo 3’OH libero necessario per l’allungamento del filamento La DNA primasi genera brevi frammenti di RNA che forniscono un 3’OH libero RNA primer circa 10 nucleotidi prodotti ad intervalli di 100-200 nucleotidi sul fiamento ritardato L’enzima RNAsi H rimuove il primer ad RNA che viene sostituito da DNA

Le interruzioni dei vari filamenti vengono saldate dall’enzima DNA LIGASI Reazione energeticamente sfavorevole pertanto viene utilizzata una molecola di ATP per favorire la reazione 1 Tappa: reazione di attivazione che utilizza una molecola di ATP 2 Tappa: reazione di “legatura” (formazioe del legame tra grupp 5’ fosfato e gruppo 3’OH

DNA elicasi Le DNA elicasi svolgono la doppia elica di DNA al livello della forcella replicativa Le elicasi si muovono ad una velocità di 1000 nucleotidi al secondo Una volta che i due filamenti sono stati svolti rimangono nello stato denaturato ad opera di proteine SSB

Proteine SSB (Single strand Binding protein) Proteine monomeriche che legano il DNA in modo cooperativo

Un anello scorrevole trattiene una molecola di DNA polimerasi sul DNA La DNApolimerasi tende a dissociarsi rapidamente dal DNA dopo aver catalizzato la polimerizzazione di pochi nucleotidi La DNApolimerasi è mantenuta sul DNA da una pinza scorrevole(Subunità b) La pinza scorrevole è caricata sul DNA dal complesso caricatore della pinza (Subunità g) della DNA polimerasi

Le proteine coinvolte nella replicazione del DNA formano un enorme complesso proteico (1MDa) e cooperano nel processo replicativo

Le DNA topoisomerasi impediscono al DNA di aggrovigliarsi Le girasi svolgono il doppio filamento di 500 basi al secondo Un intero cromosoma dovrebbe quindi ruotare di 50 giri al secondo “Problema dell’avvolgimento” Le DNA topoisomerasi risolvono tale problema Le DNA topoisomerasi sono di tipo I o di tipo II

Le DNA topoisomerasi di tipo I (ATP indipendenti) Le DNA topoisomerasi di tipo I rompono il legame fosfodiestere in un filamento di DNA Le due estremità ruotano l’una rispetto all’altra rilasciando la tensione accumulata Poiché l’energia del legame fosfodiestere è conservata nel legame fosfotirosinico, spontaneamente viene rigenerato il legame fosfodiesterico tra le basi

DNA topoisomerasi di tipo II (ATP dipendenti) Le Dna topoisomerasi di tipo II formano un legame covalente con entrambi i filamenti dell’elica producendo una rottura transitoria della doppia elica Rompe reversibilmente una doppia elica per creare un varco sul DNA Fa passare la seconda elica in prossimità del sito di rottura Risalda la rottura e si dissocia dal DNA

La reazione di passaggio dell’elica di DNA catalizzata dalla DNA polimerasi

La sintesi del DNA avviene alle origini di replicazione La bolla di replicazione è bi-direzionale I cromosomi batterici hanno in genere una singola origine di replicazione

Inizio della replicazione del DNA nei batteri

Inizio della replicazione negli eucarioti I cromosomi eucariotici hanno molte origini di replicazione

Replicazione del DNA alle estremità del cromosoma: Ruolo della Telomerasi Al livello delle estremità di un cromosoma lineare non c’è posto per produrre l’RNA primer per iniziare la sintesi dell’ultimo frammento di Okazakii I batteri risolvono il problema con cromosomi circolari La telomerasi è un complesso RIBONUCLEOPROTEICO Riconosce le sequenze telomeriche del cromosoma GGGTTA La telomerasi allunga le estremità telomeriche del cromosoma utilizzando come stampo RNA contenuto all’interno dell ‘enzima

Replicazione dei telomeri

La lunghezza dei telomeri è regolata da cellule ed organismi Attività telomerasica abbassata: Le cellule perdono 100-200 nucleotidi da ciascun telomero ad ogni replicazione Cellule staminali Attività telomerasica completa Senescenza replicativa cellulare Lunghezza telomeri - Strumento di misura per contare le divisioni cellulari - Fibroblasti 60 divisioni

Patologie associate a difetto dei meccanismi di riparo del DNA

Eventi spontanei di mutazione del DNA: Tautomeria delle basi

Eventi spontanei che avvengono al livello del DNA sono la DEPURINAZIONE e la DEAMMINAZIONE di alcune basi

Formazione dei DIMERI di PIRIMIDINE Indotti da raggi UV

Le modifiche chimiche delle basi inducono mutazioni a livello del DNA

Mutazioni per transizione e transversione

Meccanismi di riparo per ESCISSIONE DI BASE e per ESCISSIONE DI NUCLEOTIDE