Definizione  conversione di una fonte C (generalmente carboidrati) in materiale cellulare (biomassa) Ottimizzazione del processo  studio e misura dei parametri associati alla crescita cellulare: consumo fonte C, produzione ATP (tipo di metabolismo), prodotti del metabolismo (es CO2) etc   Il consumo della fonte C si puo’ semplificare con: glucosio + O2  CO2 + ATP dove l’ATP viene utilizzato per la sintesi di biomassa. La sintesi di biomassa si puo' valutare da: Glucosio consumato ATP prodotto Ossigeno consumato e/o CO2 prodotti (se il quoziente respiratorio e' 1)

Aspetti teorici della produzione di biomassa del lievito S. cerevisiae: • Il suo anabolismo è ben conosciuto • Il catabolismo del glucosio produce pochi metaboliti finali (CO2, etanolo e acqua) • Altri metaboliti prodotti in piccole quantità • Bilanci di massa semplici Teoria della crescita: • La crescita può essere rappresentata come un’equazione chimica in cui si sia effettuato il bilanciamento delle masse (C, O, H etc) • La composizione dell’equazione dipende dal tipo di crescita (cioè dal tipo di metabolismo); aerobica, anaerobica, diauxica • La composizione dell’equazione dipende dalla composizione chimica della cellula

VALUTAZIONE DELLA RESA TEORICA DEL PROCESSO 1. Valutazione della composizione della cellula nei suoi componenti principali 2. Analisi delle vie biosintetiche dei componenti (precursori > componenti) 3. Apporto del glucosio alla sintesi dei precursori 4. Dalla somma delle equazioni per ogni componente si dovrebbe ottenere una valutazione indicativa delle necessità biosintetiche della cellula Composizione media di una cellula di lievito: • Proteine (aminoacidi liberi e polipeptidi) = 39% • Carboidrati (polisaccaridi, glucano, glicogeno, polimannani, trealosio, monomeri) = 39% • Acidi nucleici (RNA ~ 10%, DNA ~ 1%) = 11% • Lipidi (lipidi neutri, trigliceridi, steroli) = 8% • Sali inorganici = 3%

Esempio per le proteine: • Valutazione della composizione della cellula in aminoacidi • Energia richiesta nelle vie biosintetiche degli aminoacidi a partire da glucosio = Sintesi dei monomeri • Energia richiesta per la polimerizzazione = Sintesi delle proteine • Sommando tutte le reazioni, per produrre 100 g di proteina di lievito a partire da glucosio, si ottiene (quantità espresse in millimoli):

Figura 17.1.2 - Metabolismo biosintetico pesato degli amminoacidi e delle basi azotate in lievito. I numeri rappresentano le millimoli di metaboliti carboniosi che passano attraverso le reazioni cataboliche e biosintetiche destinate alla sintesi di 100 grammi di cellule di lievito a partire da 1111 millimoli di glucosio. In rosa la glicolisi, in azzurro il TCA, in verde gli amminoacidi ed in giallo le basi azotate.

Ripetendo questa valutazione per tutte le componenti cellulari e sommando le reazioni si ottiene la formula che rappresenta la formazione di 100 g di materiale cellulare.

Bisogna notare che: 1. La reazione è esclusivamente biosintetica 2. La CO2 compare sia tra i reagenti che tra i prodotti, in quanto è sia il risultato del catabolismo del glucosio sia substrato per le reazioni biosintetiche di carbossilazione. 3. L’AMP è stato sostituito con l’ADP secondo la reazione AMP + ATP → 2 ADP 4. La reazione è ossidativa (consumo di ossigeno) 5. Ci vogliono circa 2 moli (1986 mmoli) di ATP per 100 g cellule 6. La reazione si può semplificare in questo modo: 732 glucosio + 831 NADPH/H+ + 1986 ATP + 17 O2 → 100 g cellule + 471 CO2 + 1408 NADH/H+ Come si può vedere si consumano ATP, NADPH/H+ e NAD+: la reazione va avanti fino ad esaurimento dei reagenti. Bisogna quindi introdurre altre reazioni che riforniscano i reagenti consumati in modo da effettuare un bilancio di massa compatibile con la crescita.

801 glucosio + 721 O2 → 100 g cellule + 761 ATP + 655 CO2 a) NADPH/H+ lo si ottiene dalla via ciclica dei pentosi: 69 glucosio + 69 ATP → 414 CO2 + 831 NADPH/H+ b) NADH/H+ lo riossido nella via respiratoria (considerando come validi nel lievito l’ottenimento di solo 2 moli di ATP per ogni NADH/H+ e che non sia possibile lo scambio tra NAD+ e NADP+): 704 O2 + 1408 NADH/H+ → 2816 ATP Bilanciando la reazione semplificata con queste ultime reazioni si ottiene: 801 glucosio + 721 O2 → 100 g cellule + 761 ATP + 655 CO2 si puo’ osservare che: • La reazione e’ bilanciata per quanto riguarda NAD e NADP • Si forma un piccolo eccesso di ATP • QR<1 (CO2 riassimilata nelle reazioni anaplerotiche)

1111 glucosio + 2581 O2 → 100 g cellule + 9441 ATP + 2515 CO2 DATI SPERIMENTALI 801 mmoli di glucosio sono 145 g. I dati sperimentali (es colture fed-batch) hanno dimostrato che e’ impossibile ottenere 100 g cellule da 145 g di glucosio, ma ce ne vogliono almeno 200 g, corrispondenti a 1111 mmoli. Dato che il surplus di glucosio non va in materiale cellulare, ma quindi in fabbisogno energetico, se viene consumato per via aerobia, bisogna aggiungere al bilancio finale la seguente reazione: 310 glucosio + 1860 O2 → 8680 ATP + 1860 CO2 e la reazione finale diventa: 1111 glucosio + 2581 O2 → 100 g cellule + 9441 ATP + 2515 CO2

Dove viene impiegato tutto questo surplus (rispetto al fabbisogno biosintetico) di ATP (circa 9.4 moli/100 g cellule)? Polimerizzazioni Mantenimento dello stato vitale (strutture, assemblaggio) Trasporto substrati Calore

PRODUZIONE DI BIOMASSA Quando il prodotto finale della fermentazione è la biomassa, il terreno deve contenere tutti componenti in concentrazione ottimale per la crescita: • fonte di C • fonte di N (ammonio, urea …) • fonte di P (fosfati) • fonte di S (solfati) • sali di K, Mg, Ca, Fe • elementi necessari in tracce (altri metalli, vitamine, fattori di crescita …) • ossigeno

BIOMASSA DA MOLASSE E la base più utilizzata per la biomassa: • basso costo • terreno composito e ricco di sali e vitamine • aggiunta di biotina alla molassa di bietola • aggiunte di inositolo e pantotenato a quella di canna (vedi sotto) Raramente si usa malto o idrolisato d’amido come fonte C. Come già visto, il lievito è una delle biomasse su cui si basa largamente la produzione, sia come alimento che come mangime. Il lievito (S. cerevisiae) è in grado di crescere su glucosio sia aerobicamente (biomassa) che anaerobicamente (etanolo e poca biomassa). Per la crescita aerobia sono necessarie: biotina, inositolo e pantotenato (peraltro presenti nelle molasse). Per la crescita anaerobia – strettamente anaerobia - sono necessari ergosterolo e acidi grassi insaturi, per la cui biosintesi sarebbe necessario l’ossigeno. L’evoluzione dei metodi di coltivazione di biomassa di lievito ha portato alla messa a punto delle colture fed-batch.

Aspetti regolativi del metabolismo e produzione di biomassa di lievito: Effetto CRABTREE (repressione da glucosio): produzione di etanolo in presenza di ossigeno Crescita diauxica: • fermentazione td = 1.7 h • respirazione td = 5-8 h • La concentazione limite di glucosio 0.2-0.3 g/L. • Durante la crescita fermentativa il ciclo TCA lavora al minimo: solo per i precursori biosintetici necessari. • Nei processi fed-batch, quando si trova etanolo nel reattore, si rallenta il flusso di glucosio (saccarosio, maltosio). • La velocità di crescita con metabolismo respiratorio dipende dalla DOT. • Rese di produzione 48-50 g peso secco per 100 g glucosio. Caratteristiche del PRODOTTO (es lievito alimentare: panificazione, birra …) • la qualita’ deve essere COSTANTE e entro gli STANDARD definiti • caratteristiche organolettiche • attivo e stabile: due caratteristiche contrastanti. Lievito ‘attivo’ = da colture in crescita in anaerobiosi: composizione in proteina aumentata ma la resa in cellule bassa e alto contenuto di proteasi (che abbassano la ‘stabilita’ del prodotto). Un lievito stabile = da coltura stazionaria aerobia: poche proteasi, ma anche poca attività enzimatica. Si preferisce quest’ultima opzione (fase stazionaria non troppo spinta)

Altri lieviti prodotti su molasse: 1. lieviti vinari (inoculi per vinificazione industriale) 2. lieviti per alimentazione (mangime, integratori alimentari ad alto contenuto proteico: vengono fatti crescere su terreni con elevate concentrazioni di azoto (>8%). Si possono usare lieviti diversi da S. cerevisiae: es del genere Candida, che hanno delle rese in biomassa più elevate, non hanno la repressione da catabolita, utilizzano fonti di carbonio meno pregiate del saccarosio o maltosio (glucosio), come i pentosi

BIOMASSA DA COMPOSTI CELLULOSICI Residui della lavorazione del legno per ricavare la cellulosa, essenzialmente quando si utilizzava il trattamento con bisolfito per separare la cellulosa dalla lignina ed emicellulosa. Il residuo liquido della lavorazione, idrolisato di emicellulosa, si chiama acqua bisolfitica (SSL spent sulfite liquor, WSL waste sulfite liquor): contiene derivati del mannosio, glucosio, galattosio e pentosi (e acidi uronici) come potenziali fonti C. Organismi: Il lievito può essere usato, ma i pentosi rimarrebbero nel terreno. Conviene quindi utilizzare altre specie, come Candida utilis o C. tropicalis, che utilizzano i pentosi, crescono rapidamente con buone rese, non producono alcol. La ricerca di organismi in grado di crescere su WSL (ricerca finlandese) e con le seguenti caratteristiche: 1. velocità di crescita elevata 2. alto contenuto proteico 3. aroma e sapore accettabili 4. facilità di separazione della biomassa dal terreno → isolamento del fungo Peacilomyces variotii impiegato nel processo chiamato Pekilo, in cui si ottiene una biomassa con contenuto proteico del 60% ed un abbattimento del BOD (biological oxygen demand) dell’83%. Il fungo, crescendo come micelio, è facilmente separabile dal terreno.

BIOMASSA DA SIERO DI LATTE Sottoprodotto delle industrie casearie: contiene lattosio e basso contenuto di azoto (principalmente lattoglobuline e albumine. Per utilizzarlo come terreno bisogna aggiungere fosfati e azoto. Gli organismi utilizzabili devono essere in grado di assimilare il lattosio: es K.lactis o C. kefir BIOMASSA DA AMIDO • La base amidacea del terreno può venire dagli scarti delle lavorazioni di vegetali (patate, riso, mais etc). • Il terreno va completato con fosfati, azoto e altri componenti mancanti nella base amidacea. • Pochi lieviti utilizzano l’amido come fonte C (amilasi). Il processo SYMBA contempla l’uso di un lievito che produce glucoamilasi (Endomycopsis fibuliger) e il lievito C. utilis. E. fibuliger idrolizza l’amido con le sue glucoamilasi ma, siccome C. utilis cresce molto più rapidamente, consuma la maggior parte degli zuccheri prodotti e la biomassa finale è essenzialmente costituita da C. utilis: amido → (E.f., glucoamilasi) → glucosio → (C.u.) → biomassa Nel processo è critico il rapporto tra le quantità dei due lieviti nell’inoculo.