Regolatori del metabolismo Regolatori delle funzioni cellulari Funzionalità delle membrane Cofattori enzimatici Molecole semplici ma spesso non abbastanza per essere sintetizzate chimicamente Presenti soprattutto nei vegetali e microrganismi Additivi per alimenti e mangimi Uso farmaceutico Produzioni: Estrazione (organi, tessuti, cellule batteriche) Sintesi chimica Microrganismi mutanti/ricombinanti Produzioni miste
In natura viene sintetizzata de novo solo da batteri e archea Non sintetizzata da funghi e piante Utilizzata ma non sintetizzata dagli animali (assimilata nel tratto gastrointestinale) Struttura troppo complessa per sintesi chimica (70 reazioni)
RUOLO DELLA B12 NEI BATTERI Trasferimento di gruppi metilici (sintesi di acetilCoA nei batteri acetogenici e trasferimento di gruppi metilici nei batteri metanogeni) Riduzione di ribonucleotidi a deossiribonucleotidi (sintesi DNA) Ossidoriduzione interna di polialcoli con produzione di acilCoA e alcoli (batteri enterici)
RUOLO DELLA B12 NELL’UOMO Cofattore di due soli enzimi: Metil malonil CoA mutasi (degradazione aminoacidi e/o lipidi metilmalonilCoA succinilCoA TCA) Metionina sintasi (omocisteina + CH3-THF metionina + THF) L’anemia perniciosa sarebbe una malattia autoimmune contro il fattore che permette l’assimilazione della vitamina e conseguente carenza ORIGINE DELLA B12 Potrebbe essere stata originata nei primi batteri (atmosfera anossica, RNA world): da essa si sono evoluti i siroemi (redox di inorganici) e poi l’eme e la clorofilla (mondo ossigenico) relegandola ad un mondo di nicchia
PRODUZIONE PER VIA FERMENTATIVA Prodotta esclusivamente per via fermentativa Diversi batteri produttori (tabella) Miglioramento ceppi per mutagenesi e selezione (100 volte incremento) o per ingegneria genetica (amplificazione operoni, promotori forti: 20-30% incremento)
Estrazione dalla biomassa Purificazione per estrazione con solventi e cromatografia a seconda del grado di purezza richiesto (additivo o farmaco)
Essenziale per l’uomo Prodotto da piante e animali (ma non dai procarioti) Funzione: cofattore di attività enzimatiche antiossidante (reagisce con forme attive di ossigeno) Produzione: circa 100.000 tonn/anno (6-8 $/kg) Uso: 50% vitamina 25% additivo alimentare 15% additivo a bevande 10% additivo a mangime 1933: sintesi chimica 1934: processo Reichstein (Chimico-biochimico)
6 passaggi chimici 1 passaggio biochimico (ossidazione regioselettiva D-sorbitoloD-sorboso) Vantaggi: rese elevate (50%) substrato di partenza economico (D-glucosio)
E’ possibile produrre acido ascorbico completamente per via fermentativa? I procarioti NON producono A. ascorbico ma producono gli intermedi del processo 2 processi alternativi possibili: via del D-sorbitolo via del 2,5 diketogulonato
D-sorbitolo L-sorbosio L-sorbone 2keto L-gulonico DH VIA del SORBITOLO Utilizza le attività PERIPLASMATCHE deidrogenasiche di Gluconobacter oxydans Rese teoricamente elevate grazie al trasporto nel citoplasma non necessario Problema di compartimentazione della sorbosone deidrogenasi (l’unica citoplasmatica): soluzione con ceppi ingegnerizzati che esprimono sorbosone deidrogenasi eterologhe periplasmatiche D-sorbitolo L-sorbosio L-sorbone 2keto L-gulonico DH
D-Sorbitol
VIA del 2,5 DiKetoGulonato (2,5DKG) Non ci sono batteri in grado di effettuare tutto il processo (glucosioascorbato) Batteri in grado di trasformare il glucosio in 2,5 DiKetoGluconato (Acetobacter, Gluconobacter, Erwinia) Batteri con 2,5 DKG reduttasi (Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacterium): 2,5DKG 2KG Processo a due fasi: D-glucosio 2,5 DKL 2 ketogulonico ascorbato Erwinia sp Corynebacterium sp chimico Unificazione del processo: Co-immobilizzazione/co-coltivazione di Erwinia e Corynebacterium condizioni di massima velocità di conversione e/o crescita diverse rese basse
D-glucosio D-gluconico 2keto gluconico 2,5 DKG DH Unificazione del processo: Erwinia ingegnerizzato con 2,5KDG reduttasi da Corynebacterium buone rese D-glucosio D-gluconico 2keto gluconico 2,5 DKG DH 2 KGulonico REDUTTASI Deidrogenasi periplasmatiche Reduttasi ricombinante citoplasmatica
ULTIMO PASSAGGIO 1 2 3 4 5 6 7
Ultimo passaggio VIA CHIMICA: due possibili processi VIA BIOCHIMICA?