La sintesi enzimatica viene utilizzata per:

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1 La sintesi enzimatica viene utilizzata per:
• la trasformazione di precursori (uno o più passaggi: uno o più enzimi) • la risoluzione di racemi Gli enzimi, estratti da microrganismi (più economici) originali o trasformati con i geni codificanti (E. coli o lievito) Punti deboli del processo: • costo • purificazione del/degli enzimi dagli organismi • labilità dell’enzima (per compensare si può immobilizzare o usare termofili) • complessità della molecola precursore

2 Esempio: produzione di L-cisteina con idrolasi da differenti specie batteriche (E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus etc) in combinazione con racemasi. Le idrolasi sono inducibili da ATC e inibite da cisteina. Sistemi in vivo: Pseudomonas thiazolinophilum

3 Esempio: produzione di amminoacidi con Idantoinasi.
Le idantoinasi sono enzimi inducibili da substrato, presenti in vari organismi (dai batteri ai superiori). Da D,L-idantoina 5-R si puo' avere D,L-aminoacido (per sintesi chimica), ovvero L-aminoacido o D-aminoacido (idantoinasi stereoselettiva). Metodo importante per la sintesi di D-aminoacidi, in combinazione con la RACEMASI (da Pseudomonas, clonata in E. coli) con conversione completa del precursore nel prodotto.

4 Esempio: produzione di L-aspartato con Liasi (aspartasi) di E. coli

5 Esempio: sintesi del triptofano
triptofanasi (E. coli, Proteus rettgeri, Bacillus) (1) triptofan sintasi (E. coli, batteri, funghi piante) (2) 2 1

6 La triptofan sintasi produce triptofano da:
indolo + serina indolil 3 glicerolo P + serina (vedi sotto) Indolo e DL serina per sintesi chimica possono essere trasformate in L-triptofano se presente anche serina RACEMASI.

7 Le triptofanasi sono state clonate ed espresse in E. coli
Le triptofanasi sono state clonate ed espresse in E. coli. L'indolo aggiunto a piruvato e ammoniaca viene convertito quasi completamente in triptofano con produzioni fino a 100 g/L.

8 Esempio: produzione di amminoacidi con deidrogenasi attive su -ketoacidi

9 La sintesi chimica (salvo sintesi asimmetrica e/o substrati chirali) porta quasi inevitabilmente a miscele racemiche di aa. Si sono sviluppati quindi diversi metodi per la risoluzione di racemi, tra i quali metodi: chimico-fisici (cristallizzazioni selettive da soluzioni racemiche soprasature con inneschi chirali, cromatografie con eluenti chirali, cristallizzazioni con acidi/basi chirali) microbici enzimatici I metodi enzimatici sono i più usati e sfruttano enzimi stereospecifici. I due metodi enzimatici più comuni sono la derivatizzazione asimmetrica e la idrolisi asimmetrica. Derivatizzazione asimmetrica: si basa sulla formazione di amidi insolubili (diversificazione delle fasi) usando anilina (NH2-C6H5) come reagente e PAPAINA come enzima. Idrolisi asimmetrica: si basa sulla diversa solubilità dei prodotti e si usano Esterasi (es chimotripsina, enzima proteolitico) Amidasi (microbiche o da mammifero) Aminoacilasi (molto abbondanti in funghi dei generi Aspergillus e Penicillium, presenti anche in batteri e mammiferi)

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11 L’ N-acil aminoacido racemizza chimicamente più rapidamente del corrispondente aminoacido e quindi si può avere la conversione completa a partire dalla miscela di DL-N-acil aminoacido. Esistono anche RACEMASI attive solo su N-acil aminoacidi e non su amino acidi (diffuse tra gli streptomiceti).