Trasporti attraverso la membrana Proteine di trasporto

Una membrana costituita da un puro bilayer fosfolipidico è impermeabile alle proteine e alla maggior parte delle piccole molecole Gas Etanolo Piccole molecole polari non cariche Acqua Urea Grosse molecole polari non cariche Glucosio Ioni Molecole polari cariche Aminoacidi ATP Glc-6-P

Proteine di trasporto 2 principali classi di proteine di trasporto: Proteine Carrier Proteine Canale bilayer lipidico soluto sito di legame del soluto ione poro acquoso

Diffusione Facilitata

Caratteristiche dei trasporti mediati I carriers sono dotati di specificità Sono soggetti a saturazione Possono essere bloccati dagli inibitori competitivi Hanno un’elevata dipendenza termica e dal pH

I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi Legano selettivamente il loro substrato, cioè la molecola che deve essere trasportata Cambiano di conformazione per rilasciare il substrato dall’altro lato Ritornano alla conformazione originale per legare un’altra molecola di substrato Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten

Analisi cinetica del transporto di una molecola tramite proteina carrier: saturazione In base alla Ia legge di Fick il flusso di particelle che diffondono liberamente aumenta linearmente all’aumentare della concentrazione Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata se si tratta di un flusso di particelle attraverso la membrana mediato da carriers Fmax 10 20 30 100 200 300 F D C F=kdDC 50 100 150 200 5 10 15 20 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) 104 I flussi mediati da carriers -a differenza della diffusione libera - sono saturanti Ciò accade per due motivi: Sulla membrana è presente un numero finito di carriers; Ciascun carrier opera ad una velocità finita

Rappresentazione del concetto di saturazione con un esempio numerico Velocità del carrier: 50 part./s Per semplicità consideriamo una membrana con un solo carrier 800 1000 10 20 30 40 50 Flusso (Particelle/Carrier/s) N. particelle N. partic. Flusso 1 100

Quesito su cui meditare Distruggendo, o bloccando irreversibilmente con un farmaco la metà dei carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe?

I carriers, come gli enzimi, possono essere soggetti ad inibizione competitiva Fmax 50 100 150 200 5 10 15 20 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) 104 + Ic + Ic

Come funziona un inibitore competitivo? solo S S << Ic S >> Ic substrato Inibitore comp.

In presenza di Ic varia ka Calcolo della costante di affinità ka Quindi, in presenza di inibitore competitivo il valore di Fmax non cambia. In presenza di Ic varia ka Calcolo della costante di affinità ka 50 100 150 200 5 10 15 20 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) 10 20 30 5 15 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) ka1 ka2 ka3 ka è quel valore di concentrazione del substrato al quale il flusso è la metà di quello massimo ka è inversamente proporzionale all’affinità del carrier per il substrato

Quesito del giorno Un ricercatore trova che la velocità con cui una sostanza è trasportata all’interno di certe cellule varia al variare della sua concentrazione come illustrato in tabella. Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo che l’area di membrana su cui sono state fatte le misure è 3·10-2 cm2; Rappresentare graficamente i valori del flusso al variare della concentrazione di substrato in due grafici distinti ove le concentrazioni sono rappresentate rispettivamente in forma lineare e logaritmica; Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka. Conc. mM v (mmol/s) 1 10.0 5 16.7 10 18.2 20 19.0 30 19.4 50 19.6 100 19.8 200 19.9 0.1 3.0

Quesito su cui meditare Distruggendo, o bloccando irreversibilmente con un farmaco la metà dei carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe? Questo corrisponde al caso di un inibitore non competitivo o allosterico Il loro legame all'enzima (trasportatore),in un sito diverso dal sito attivo, genera un cambiamento conformazionale dell'enzima (trasportatore) stesso, che può avere come conseguenza l'inibizione del legame tra enzima (trasportatore) e substrato. Non essendoci dunque competizione tra inibitore e substrato, verrà modificato Fmax ma NON Ka..

Risposta al quesito 50 100 150 200 300 400 500 600 700 mmoli/s/cm 50 100 150 200 300 400 500 600 700 mmoli/s/cm 2 Concentr. 0.01 0.1 1 10 100 200 300 400 500 600 700 mmoli/s/cm 2 Concentr.

Diffusione Facilitata soluto stato A stato B esterno bilayer lipidico gradiente di concentrazione interno proteina carrier sito di legame del soluto es. Trasportatore del glucosio negli epatociti La driving force per il trasporto in qualsivoglia direzione è determinata dal gradiente di concentrazione attraverso la membrana

Alcune considerazioni di bioenergetica L’energia è la capacità di compiere un lavoro Un sistema all’equilibrio non può compiere un lavoro. Esso è al minimo della collina energetica Energia del Sistema Equilibrio

La parte di Energia che il sistema può utilizzare per compiere un lavoro è definita energia libera del sistema Le reazioni non all’equilibrio spontaneamente procederanno nella direzione che porta all’equilibrio Tali reazioni sono dette esoergoniche Una reazione può essere forzata a procedere in senso non spontaneo. In questo caso la reazione assorbe energia: cioè occorre compiere un lavoro sul sistema Una reazione di questo tipo è detta endoergonica

Le reazioni chimiche accoppiate Un processo endoergonico può avvenire se esso viene opportunamente accoppiato ad un processo esoergonico

Trasporti passivi e attivi a confronto molecola trasportata proteina carrier bilayer lipidico gradiente di concentraz. diffusione semplice mediata da canale mediata da carrier trasporto passivo trasporto attivo

Trasporti passivi e attivi a confronto Il gradiente di concentrazione attraverso la membrana determina la direzione e la velocità della diffusione passiva. Nella diffusione passiva le molecole si muovono dalla zona ad alta concentrazione a quella a bassa concentrazione (trasporto “in discesa”) Diffusione semplice: le molecole diffondono attraverso il bilayer lipidico Diffusione facilitata: diffusione attraverso la membrana mediata da proteine di trasporto (non è richiesta energia) Muovere un soluto “in salita” (contro il gradiente di concentrazione) richiede un apporto di energia - Trasporto Attivo

Gradiente elettrochimico Trasporti Attivi Il trasporto di un soluto contro un gradiente elettrochimico richiede l’utilizzo di energia Due strategie sono adottate dalle cellule animali: Pompe ATP-dipendenti Trasporti accoppiati Trasporto in salita di una molecola accoppiato al trasporto in discesa di un’altra Trasporto in salita accoppiato direttamente all’idrolisi dell’ATP Gradiente elettrochimico

Ciclo della pompa Na+/K+ ATPasi la proteina subisce un cambiamento conformazionale, il Na è rilasciato all’esterno fosforilazione ATP-dipendente ext int il Na si lega al sito citosolico il K si lega al sito extracellulare la proteina ritorna alla conformazione originale, il K è rilasciato all’interno defosforilazione 1 ciclo  10 millisecondi

Alcune importanti caratteristiche della pompa Na/K ATPasi Stechiometria - 3 Na+ fuori, 2 K+ dentro, 1 ATP usato È responsabile di >30% del consumo totale di ATP Mantiene un gradiente del Na+ (ext>int) e del K+ (int>ext) La velocità dipende dalla concentrazione intracellulare di Na+ È elettrogenica: può generare direttamente da -2 a -20 mV di d.d.p. Tiene la pressione osmotica sotto controllo, prevenendo il rigonfiamento cellulare È bloccata dal glicoside cardiaco ouabaina e da una bassa [ATP]i Ione Intracellulare Extracellulare Na+ 5-15 mM 145 mM K+ 140 mM 5 mM

Gradiente elettrochimico A cavallo della membrana della maggior parte delle cellule c’è una differenza di potenziale elettrico – il potenziale di membrana Il potenziale di membrana influenza il movimento transmembrana di tutte le molecole cariche (ioni) Il lato citoplasmatico della membrana plasmatica di solito ha un potenziale più negativo rispetto all’esterno La forza elettrostatica spinge i cationi nella cellula e guida gli anioni fuori Quindi, quando consideriamo la diffusione passiva di soluti carichi attraverso una membrana, due forze devono essere considerate: (a) il gradiente di concentrazione transmembrana (b) la differenza di potenziale transmembrana La driving force netta = Gradiente Elettrochimico

Gradiente Elettrochimico fuori dentro potenziale di membrana=0 potenziale di membrana negativo dentro  trasporto dei cationi aumentato potenziale di membrana positivo dentro  trasporto dei cationi ridotto

Quesito del giorno In base a quanto detto a lezione, stabilire se la pompa Na+/K+, che è elettrogenica dal momento che trasporta un numero netto di cariche elettriche, aumenterà o diminuirà la sua velocità d’azione qualora la membrana venga depolarizzata. Ricordarsi che una depolarizzazione comporta un aumento delle cariche positive all’interno della cellula rispetto alla situazione di riposo (potenziale di riposo).

Alcune definizioni molecola trasportata ione co-transportato ione contro-transportato Uniporto Simporto Antiporto Trasporti accoppiati

Un altro esempio di trasporto attivo primario

Gradiente elettrochimico Trasporti accoppiati o Attivi secondari Il gradiente di un soluto (es. gradiente del Na+) viene usato per guidare in salita il trasporto di una seconda molecola - trasporto attivo secondario Gradiente elettrochimico Trasporto in salita di una molecola accoppiato al trasporto in discesa di un’altra

Trasporti accoppiati al gradiente di Na Nelle cellule animali molti processi di trasporto di membrana sono accoppiati al gradiente del Na. Es. Trasporto del glucosio in cellule dell’epitelio intestinale gradiente di Na Na+ glucosio stato A B gradiente di glucosio int ext carrier Stechiometria: 2 Na+  1 Glc Bloccante: florizina

Altri esempi di trasporti attivi secondari

Quesito del giorno Una cellula si trova immersa in una soluzione extracellulare contenente glucosio 10 mM. Trascorso un certo tempo la concentrazione di glucosio nel citoplasma sale a 50 mM. Secondo voi, perche’ cio’ prova che la membrana plasmatica di quella cellula dispone di un trasportatore attivo del glucosio? Come fareste a dimostrare sperimentalmente che tale trasportatore e’ Na+-dipendente (trasporto attivo secondario)?

Mantenimento dei livelli di Ca2+ intracellulare Il Ca2+ è coinvolto in molti processi cellulari Il mantenimento di bassi livelli di Ca2+ intracellulare è critico per il normale funzionamento cellulare La [Ca2+] extracellulare è >> della [Ca2+] intracellulare Le pompe del Ca2+ ATP-dipendenti della membrana plasmatica e del reticolo endoplasmatico pompano attivamente Ca2+ fuori dal citoplasma Esiste anche uno scambiatore Na/Ca (T.A.II) che pompa attivamente Ca2+ fuori dalla cellula

Flussi passivi ne aumentano la concentrazione intracellulare I gradienti di calcio esistono sia all’interno della cellula che a cavallo della membrana plasmatica Flussi passivi ne aumentano la concentrazione intracellulare Contrazione Secrezione Esocitosi Espressione di geni Secondo messaggero Ca2+ Ca2+

Ca2+ La concentrazione del Ca2+ nel citosol è riportata a livelli bassi da flussi attivi ATP Ca2+ Ca2+ + Ca2+ Ca2+ Ca2+ Na+

I canali ionici permettono dei flussi molto rapidi e intensi Tipo di trasportatore Velocità di turnover Pompe ioniche 2-5·102/sec Glucoso-permeasi 103-104/sec Canale del Na+ ~108/sec

Struttura di base di un canale ionico bilayer lipidico Lato extracellulare Lato citoplasmatico Poro acquoso Filtro di selettività Residui di zuccheri

Canale ionico in 3D – Porina Canale ionico in 3D – Shaker K+ Unica subunità Canale ionico in 3D – Shaker K+ Quattro subunità

Alcuni canali ionici sono estremamente selettivi nei confronti dei vari ioni La selettività può essere conferita da una combinazione di diversi fattori Uno di questi è la presenza di cariche elettriche fisse sulla parete interna del canale di intensità e densità specifiche

Passaggio in singola file di ioni K+ attraverso il poro del canale

Canali Ionici: classificazione in base alle modalità di apertura Sempre aperti extracell. intracell. Voltaggio-dipendenti: rispondono a variazioni di Vm Chemio-dipendenti: rispondono a un messaggero extracellulare neurotrasmettitore Chemio-dipendenti: rispondono a un secondo messaggero (intracellulare) cAMP, cGMP, Ca2+, IP3, proteine G

Struttura di base di un canale voltaggio-dipendente Lato extracellulare Lato citoplasmatico Sensore del voltaggio porta Filtro di selettività

Concentrazioni ioniche intracellulari ed extracellulari Ione Intracellulare Extracellulare Na+ 5-15 mM 145 mM K+ 140 mM 5 mM Mg2+ 0.5 mM 1-2 mM Ca2+ 10-7 mM 1-2 mM H+ 10-7.2 M (pH 7.2) 10-7.4 M (pH 7.4) Cl- 5-15 mM 110 mM Anioni fissi high 0 mM La [intracellulare] è molto diversa dalla [extracellulare] I cationi sono bilanciati dagli anioni