Produzione di etanolo (bioetanolo) carboidrati etanolo Microrganismi Anaerobi o anaerobi facoltativi: Lieviti (es. S. cerevisiae) Batteri (es. Z. mobilis) Additivo carburanti Bevanda Importanza crescente Produzione a basso costo Produzione da fonti rinnovabili materie prime lavorazione fermentazione Zuccheri semplici (monomeri e /o dimeri fermentabili: glucosio, saccarosio, maltosio) → uso diretto Polimeri (amido, cellulosa, emicellulosa) → pretrattamento/idrolisi Fino al 75% del costo del processo

Barbabietola da zucchero Materiale Substrato Stock Lavorazione Vantaggi Svantaggi Prodotti secondari Piante da zucchero: Barbabietola Canna Topinambur Melassi Saccarosio < 12 mesi Frantumazione Preparazione minima Alte rese per ha Prodotti secondari (mangimi, fertilizzanti) Stoccaggio Coltivazione non diffusa Lievito Residui di distillazione Fibre a basso valore Piante da amido: Mais Frumento Cassava Patata dolce Amido 12 mesi Macinazione Liquefazione Saccarificazione Coltivazione diffusa Prodotti secondari (mangimi) Preparazione complessa Prodotti secondari con aflatossine Granuli secchi (DDG) Polpe Materiali cellulosici Cellulosa Emicellulosa > 12 mesi Idrolisi Disponibilità/costi Mercato non sovrapposto Idrolisi costosa e non competitiva topinambur cassava Barbabietola da zucchero Canna da zucchero Patata dolce

Etanolo da melassa (canna, barbabietola): Prodotto in Brasile, India, Sud africa, Francia Saccarosio → [invertasi]→ glucosio → [fermentazione]→ etanolo Rese >95% Microrganismi: S. cerevisiae, Z. mobilis Etanolo da amido: Prodotto in USA (mais), Francia (frumento) e Cina (patate) Pretrattamenti con amilasi (saccarificazione o liquefazione + saccarificazione) Liquefazione con α-amilasi (endo) batteriche o fungine (vari pH e T ottimali di reazione) Saccarificazione con β-amilasi (eso) o glucoamilasi (eso) Produzione diretta di etanolo da S.c. e/o Z.m. ricombinanti (esprimenti amilasi): ancora poco efficienti su larga scala α-amilasi: lasciano il C1 in forma α (meccanismo) β-amilasi: lasciano il C1 libero del maltosio in forma β, attaccano dall’estremità non riducente (C6) glucoamilasi: attive su tutti i legami (α1-4, α1-6, α1-3) Amido: α1-4

Meccanismo di azione dell’α-amilasi (endo) Intermedio β legato all’enzima Rilascio di α per idrolisi O CH2OH OH O-R2 R1-O HO Asp-COO- Glu-COO-H Asp-CO Glu-COO- H Glu-COOH (α) α-amilasi Maltosio: C1 libero β

Strategie di idrolisi delle sostanze amidacee

Materie prime ligno-cellulosiche Residui forestali, residui lavorazione cellulosa, residui lavorazioni agricole/industriali, rifiuti urbani/domestici Principale riserva di energia e biomassa della biosfera Bassi costi della materia prima ma tecnologia di saccarificazione ancora non competitiva Limiti principali: Costo del pretrattamento Costo degli enzimi Difficoltà all’uso dei pentosi per la fermentazione

Costituzione legno: Lignina (poli fenil-propano, eterogenea) Cellulosa (β1-4, omopolimero) Emicellulosa (eteropolimero) Pectina (poligalatturonico α1-4 metil-esterificato, con anche ramnosio, galattosio e altri)

Trattamento dei composti ligno-cellulosici 1° fase – Separazione della lignina: metodi chimico-fisici (frantumazione, esplosione, solventi, ligninasi) problema dell’idrolisi contemporanea dell’emicellulosa problema della produzione/uso di sostanze inibitorie per la fermentazione (esempio SO2) uso di piante mutanti con strutture più aggredibili 2° fase – Idrolisi dei polisaccaridi (cellulosa e emicellulosa) metodi chimici (acidi) metodi enzimatici (endo ed eso-glucanasi, enzimi batterici e fungini)

anaerobiosi aerobiosi Produzione di etanolo: presenza di PDC e ADH Glucosio (zuccheri fermentabili) Gliceraldeide 3-P Piruvato Glicerolo Acetaldeide + CO2 Etanolo CO2 + H2O GLICOLISI Ciclo dei PENTOSI Via ED Ciclo di KREBS Via del Glicerolo Via etanologenica PDC ADH Metabolismo anaerobio alternativo Lattato LDH Microrganismi anaerobi e anaerobi facoltativi: Lieviti (S. cerevisiae) Batteri (Z. mobilis) Proprietà di produzione: Alte rese (g/g) Alte produttività (g/gh) Alte produzioni (g/l) Tolleranza al prodotto anaerobiosi aerobiosi

Vie metaboliche coinvolte: glicolisi

Entner-Doudoroff

Via dei pentosi

Glicerolo deidrogenasi Via del glicerolo Gliceraldeide 3-P DHAP TPI Glicerolo 3-P Glicerolo deidrogenasi NADH/H+ NAD+ Glicerolo + Pi Glicerolo fosfatasi

Ciclo di Krebs Piruvato PDH CoASH, NAD+ CO2, NADH/H+

Repressione da catabolita/glucosio – Effetto Crabtree ALTRE FONTI C RESPIRAZIONE GLUCONEOGENESI biosintesi

Alcol da batteri (senza PDC) 1 = piruvato deidrogenasi 2 = acetil-CoA sintetasi 3 = alcol deidrogenasi

Metabolismo dei pentosi: Xilulosio, ribulosio e ribosio possono essere utilizzati attraverso la via dei pentosi. Xilosio (emicellulosa) e/o arabinosio devono essere modificati. XYL1 e XYL2 (da P. stipitis) clonate in S. cerevisiae per fermentare pentosi ma poco efficiente per sbilanciamento NAD+/NADP+) XYLA (isomerasi) XYL1 (NADPH/H*) (xilosio reduttasi XR) XYLB (kinasi) XYL2 (NAD+) (xilitolo deidrogenasi XDH)

Preparazione della biomassa in coltura fed-batch (aerobica) Processi Preparazione della biomassa in coltura fed-batch (aerobica) Produzione dell’etanolo in coltura batch (anaerobica): Volume 500-1000 m3 Glucosio 130-170 g/l Inoculo 20% Temperatura 35°C pH 4,5 – 5,5 Resa 0,46 g/g (teorica 0,51 g/g: 1 glucosio > 2 etanolo+2 CO2) Produzioni in continuo Riciclo biomassa (X) Riciclo fonte di carbonio (S) S0 P S X F1 F2 X P S S P Fs FX