INGEGNERIA METABOLICA Incremento della produzione di un metabolita: Deviazione del flusso metabolico Alterazione della regolazione della biosintesi del metabolita Alterazione della secrezione/trasporto del metabolita Produzione di un nuovo metabolita: Introduzione di nuovi geni strutturali Regolazione della nuova via metabolica Attività dei nuovi enzimi Flusso metabolico Trasporto del nuovo metabolita Effetti fisiologici del nuovo metabolita

CH3COCOOH + NH4+ + NADH/H+ → CH3CHNH3COOH + H2O + NAD+ Impiego attuale dell’ L-alanina: dolcificante e terapie nutrizionali pre e post-operatorie Produzione in fermentatore da vari batteri (Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter etc) con rese 50-60% da glucosio: problema delle racemasi nei produttori (biosintesi parete  D-ala) Bioconversione stereoselettiva con cellule di Pseudomonas dacunhae immobilizzate: L-aspartato  L-alanina + CO2 (rese >90%) Ingegneria metabolica con ceppi di E. coli e Z. mobilis che esprimono Alanina Deidrogenasi (L-AlaDH): CH3COCOOH + NH4+ + NADH/H+ → CH3CHNH3COOH + H2O + NAD+

Insoluto il problema della racemasi. In Z. m. si ottengono alanina ed etanolo. In E. c. il potere riducente e’ fornito dall’espressione contemporanea di Formiato Deidrogenasi (FDH) in presenza di ammonio formiato: piruvato + NH4HCOO + NADH/H+  alanina + HCOOH + H2O + NAD+ HCOOH + NAD+  CO2 + NADH/H+

USO DEI Batteri Lattici (LAB), in particolare Lactococcus lactis Capacità biosintetica limitata e non accoppiata al catabolismo (No TCA, no fosforilazione ossidativa) Fermentazione omolattica (glucosio  lattato): l’ATP viene solo dalla fosforilazione a livello del substrato (glicolisi) Vie di utilizzo del piruvato alternative alla LDH (fig.1): 1.Piruvato Deidrogenasi (PDHC), 2.Piruvato Formiato Liasi (PFL) e 3.Aceto Lattato Sintasi (ALS) 1- Piruvato  Acetil-SCoA + CO2 + NADH/H+  acetato ( NADH/H+ ) etanolo 2 - Piruvato + H2O  formiato + acetato ( NADH/H+ ) etanolo 3 - Piruvato + TTP  CH3CHO-TTP + CO2 CH3CHO-TTP + piruvato  acetolattato CH3-CO-C(CH3)OH-COOH acetolattato  acetoina + CO2 CH3-CO-CHOH-CH3 acetoina + NADH/H+  2,3 butandiolo CH3-CHOH-CHOH-CH3 Il NADH/H+ viene dalla glicolisi o da PDHC (C=complesso enzimatico)

Produzione di L-alanina da L. lactis ingegnerizzato Principi di ingegneria metabolica: Introduzione di una nuova via (alanina deidrogenasi) Indirizzamento del flusso metabolico (lattico deidrogenasi e racemasi) CARATTERISTICHE DEGLI Enzimi LDH e L-AlaDH: Stesso substrato (piruvato), stesso cofattore (NADH/H+) Km per il substrato (piruvato) simile

Figure 1: Rerouting carbon flux toward l-alanine by overproduction of alanine dehydrogenase (l-AlaDH) in an l-lactate dehydrogenase (l-LDH) and alanine racemase (ALR)-deficient strain. The alternative pathways of pyruvate catabolism in the l-LDH–deficient strain18 take place through -acetolactate synthase ( -ALS), pyruvate dehydrogenase complex (PDHC), and pyruvate formate lyase (PFL). The KM values for pyruvate and NADH of l-LDH and l-AlaDH are indicated between brackets.

COS’E’ LA NISINA? Antagonista batterico (Lantibiotico) di 34 aminoacidi e contenente lantionina Struttura lantionina: HOOC-CH(NH2)-CH2-S-CH2-CH2(NH2)-COOH BIOSINTESI della NISINA: nisA = gene strutturale nisB, nisC = modificazioni postraduzionali nisT = trasporto nisP = modificazioni precursori extracellulari nisI, F, E, G = immunità nisR = regolazione (attivatore) nisK = regolazione (sensore, kinasi)

Ceppo utilizzato L.lactis NZ3900 (geni nisKR integrati) + Gene alaD (B. sphaericus) con promotore nisA

CARATTERISTICHE Ceppi USATI NZ3900 wt NZ3950 LDH PH3900 ALR PH3950 LDH ALR DATI Sperimentali: Attività alanina deidrogenasica in NZ3950 FIGURA 2 Attività L-AlaDH in funzione della concentrazione di nisina Inibizione attività oltre 1 ng/ml A 0.75 ng/ml L-AlaDH e’ il 20% della proteina totale come attività e il 30-40% come proteina (non tutto l’enzima prodotto e’ attivo) Risultati simili in NZ3900

Figure 2: Nisin-dependent overproduction of alanine dehydrogenase. (A) Effect of nisin concentration on l-AlaDH specific activity. (B) Coomasie brilliant blue-stained gel after SDS–PAGE of cell extracts from cultures induced with increasing concentrations of nisin (ng/ml) as indicated above each lane. Molecular mass markers (in kilodaltons) are indicated on the left, and the l-AlaDH band is indicated by arrow.

CH3COCOOH + NH4+ + NADH/H+ → CH3CHNH3COOH + H2O + NAD+ PRODUZIONE 1° fase: produzione biomassa e induzione dell’alaDH con nisina 2° fase: sospensione biomassa in terreno di produzione (buffer fosfato 100mM pH7 con glucosio e ammonio acetato) FIGURA 2: produzioni (rese) in funzione della concentrazione della nisina e dell’ammonio CH3COCOOH + NH4+ + NADH/H+ → CH3CHNH3COOH + H2O + NAD+

Figure 3: Alanine production as a function of nisin concentration and ammonium supply. (A) Effect of nisin concentration on alanine production by cell suspensions of the wild-type NZ3900 strain (black bars) and the l-LDH–negative NZ3950 strain (hatched bars). (B) Effect of ammonium acetate supply on alanine production. (Experimental conditions were as in (A) except that the cells were induced at a fixed nisin concentration of 0.5 ng/ml). Symbols as in (A).

COMPETIZIONE CON PRODOTTI SECONDARI FIGURA 4 Nel ceppo NZ3900 (selvatico) la competizione è solo tra LDH e alaDH 100 glucosio 65 lattato 35 alanina Nel ceppo NZ3950 (LDH) la competizione è tra alaDH e gli enzimi che portano agli altri prodotti finali (ALS, PFL e PDHC) 100 glucosio 50 alanina 35 acetoina 8 etanolo 2 formiato 1 lattato

Figure 4: End products formation by cell suspensions of the wild-type NZ3900 strain (black bars) and the l-LDH–deficient NZ3950 strain (hatched bars), each harboring pNZ2650. Cells were induced at a fixed nisin concentration of 0.5 ng/ml. Production of acetate, 2,3-butanediol, and pyruvate was not observed.

PRODUZIONE a pH CONTROLLATO (pH7.5) Dipendenza della produzione dal pH. L’attività alanina deidrogenasica e l’aminazione sono favoriti a pH alti; massima produzione di alanina ottenuta a pH 8.5 Produzione a pH 7.5 (controllato per aggiunta di NaOH,FIGURA 5): La resa in alanina non varia nel selvatico ma passa dal 50% al 75% (140mM: resa max teorica 200mM di alanina da 100mM glucosio) in ceppo LDH. Gli altri prodotti solo in tracce (ad esempio la ALS e’ inibita a pH alti). Usato solfato di ammonio invece dell’acetato per facilitare i bilanci di massa

ala Figure 5: Time course of glucose consumption and alanine and lactate production by (A) the wild-type NZ3900 strain and (B) the l-LDH–deficient NZ3950 strain, each containing pNZ2650. Cell suspensions were initially supplemented with 100 mM glucose and 100 mM (NH4+)2SO4, and the pH was maintained at 7.5 with NaOH.

DIPENDENZA DELLA CONCENTRAZIONE DI AMMONIO FIGURA 6 Aumentando da 100 mM (teoricamente sufficiente alla conversione di 100 mM glucosio in 200 mM alanina) a 150 mM (eccesso molare) la concentrazione del solfato di ammonio si ha la quasi completa conversione di 100 mM glucosio in alanina 200 mM (resa molare =2) Problema della lisi cellulare (fino al 12%) ridimensionato aumentando la concentrazione di ammonio.

Figure 6: 13C NMR spectrum (0–200 p. p. m Figure 6: 13C NMR spectrum (0–200 p.p.m.) of end products from a cell suspension of the l-LDH–deficient NZ3950 strain containing pNZ2650 initially supplemented with 100 mM glucose and 150 mM (NH4+)2SO4 after 17 h of fermentation at pH 7.5.

USO DI MUTANTI SENZA RACEMASI In produttori naturali (Corynebacterium, Brevibacterium etc) la % di D-ala e’ elevata Nei LAB produttori ingegnerizzati (NZ3900 e NZ3950) e’ piu’ bassa (10-15%) Nei LAB produttori ingegnerizzati con inibitore della racemasi (D-cloroalanina) e’ ancora piu’ bassa (<3%) Nei produttori ingegnerizzati e mutati ALR (PH3900 e PH3950) si ha SOLO L-Ala (racemasi  unico gene) Processocon mutanti racemasi: coltivazione in terreno con nisina e D-ala aggiunta (necessaria per la crescita)  lavaggio cellule  bioconversione Hols P et al. Conversion of Lactococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering (1999) Nature biotechnology 17:588-592