ANALISI DEI DATI CON L’UTILIZZO DEL SOFTWARE SIGMAPLOT CORSO DI BIOCHIMICA COMPUTAZIONALE ANALISI DEI DATI CON L’UTILIZZO DEL SOFTWARE SIGMAPLOT Anno accademico 2008-09 Dott.ssa Serena Faggiano

ESEMPI DI DATI BIOCHIMICI COME ELABORARE I DATI Cosa faremo: Importare i dati Normalizzare i dati Costruire un grafico Effettuare il fitting dei dati con l’opportuno modello Ricavare i valori d’interesse che ci permettono di descrivere il sistema ESEMPI DI DATI BIOCHIMICI Misure di legame di ligandi gassosi all’emoglobina: MISURE DI AFFINITÀ - costruzione di una curva di legame e di un Hill plot, misura del coefficiente di Hill (n) e dell’affinità (p50). MISURE CINETICHE - misura della velocità di legame di un ligando gassoso, studio della dipendenza dalla T o dalla concentrazione di ligando.

MISURE DI AFFINITÀ - CURVA DI LEGAME dell’O2 all’Hb I dati sperimentali vengono da: TITOLAZIONE DELL’Hb CON O2 L’emoglobina in soluzione viene equilibrata con un gas avente una nota pressione parziale di ossigeno (pO2), si misura uno spettro di assorbimento tra 450 nm e 700 nm, si ripete equilibrando con un gas avente pO2 maggiore, ecc… tonometro O2 da gas-mixer Cella di uno spettrofotometro

ANALISI DEI DATI: A ciascuno spettro di assorbimento, ottenuto ad una data pO2, viene associata la relativa frazione di saturazione (Y), cioè la frazione di gruppi eme che hanno legato l’ O2. Per fare ciò, si possono usare 2 metodiche: 1) Deconvoluzione degli spettri come somma “pesata” di spettri di riferimento della forma deossigenata, ossigenata e met.

555 nm = picco della forma deossigenata 2) Uso del rapporto tra l’assorbanza a 577 nm e quella a 555 nm (A577/A555): 555 nm = picco della forma deossigenata 577 nm = uno dei 2 picchi della forma ossigenata Il rapporto A577/A555 sarà massimo per la forma 100% ossigenata (Y=1) e minimo per la forma deossigenata (Y=0). Si ricava così Y a ciascuna pO2. 555 nm 577 nm

f=xn/(xn+p50n) f=n·x-n·log(p50) Ricavata Y a ciascuna pO2, si costruisce la curva di saturazione o il grafico di Hill. Da entrambi si può ricavare l’affinità e la cooperatività. f=xn/(xn+p50n) f=n·x-n·log(p50)

I dati sperimentali vengono da: ESPERIMENTO DI STOPPED FLOW MISURE CINETICHE - VELOCITÀ DI LEGAME del CO ad AHb1 e AHb2 (emoglobine di pianta) I dati sperimentali vengono da: ESPERIMENTO DI STOPPED FLOW Si misura come varia nel tempo l’assorbanza ad una singola lunghezza d’onda (430 nm) 430 nm dalla deossi Hb alla carbossi Hb

ANALISI DEI DATI: 1) Si eliminano i dati che ricadono nel tempo morto dello strumento (1.5 ms) 2) Per visualizzare meglio la cinetica a tempi brevi, si visualizzano i dati su scala delle x (tempi) logaritmica 3) Si effettua il fitting con una curva esponenziale (monoesponenziale, biesponenziale, ecc), ricavando così la/le velocità del processo Utilizzando tali costanti di velocità: 4) Se si sono acquisiti i dati ad una fissa concentrazione di CO e a diverse temperature, si può costruire il grafico di Arrhenius per determinare l’energia di attivazione del processo. R = 8.314472 J K-1 mol-1

LA SCHERMATA DI SIGMA PLOT

COMANDI UTILI NB: il programma lavora sulle COLONNE (grafici, operazioni, fitting) File - Import - File (per importare i dati) Evidenziare la riga - CtrlC - evidenziare la colonna di destinazine - Edit - Traspose paste (per mettere i dati da una riga ad una colonna) Evidenziare le celle che si vuole eliminare - Insert - Delete cells - Shift cells up (per tagliare i primi dati, ad es. per eliminare i dati che cadono nel tempo morto dello strumento) Graph - Create graph (per visualizzare i dati in un grafico) Statistics - Regression Wizard (per effettuare il fitting) Transform - Quick transform o User-Defined (per fare delle operazioni sui dati nelle colonne, es fare il log, il reciproco, ecc.)

COMANDI UTILI 2 Esempio di User-Defined transform: for n=2 to 30 step 2 do col(n)=col(n)-min(col(n)) col(n)=col(n)/max(col(n)) end for Selezionare il worksheet – tasto destro sul mouse – copy – selezionare il notebook – paste (per fare un nuovo worksheet, copia del precedente) Cliccare due volte sulla colonna per dare un nome alla colonna Per normalizzare dei dati: col(n)=col(n)-min(col(n)) per portare a zero, quindi: col(n)=col(n)/max(col(n)) per avere come valore massimo 1.