Canali Voltaggio-dipendenti per il Ca2+

La struttura molecolare dei canali del Ca2+ è nel suo insieme del tutto simile a quella dei NaV, sebbene (piccole) differenze nelle sequenze cambino profondamente la selettività, il gating e la sensibilità ai farmaci. Le subunità alfa sono costantemente associate a subunità accessorie, in numero maggiore di quelle del Na+: α2, β, γ e δ. I canali del Ca VD sono tutti bloccati (pur con sensibilità diverse) dal Cadmio (Cd2+) e dai “metalli pesanti” (Ni2+, Co2+ e La3+).

Organizzazione strutturale dei canali del Ca VD Subunità a1: 4 domini omologhi (I-IV), con 6 segmenti transmembrana ciascuno; Subunità b: intracellulare, costituita da più a eliche; Subunità a2d: in giallo le regioni idrofobiche; I siti di interazione tra le subunità sono indicati da frecce bipolari.

Classificazione in base alle proprietà elettrofisiologiche: a) Canali LVA (low-voltage-activated (-70mV); avendo una spiccata inattivazione voltaggio-dipendente, sono stati chiamati canali T (“transient”). Sono sensibili all’amiloride. b) Canali HVA (high-voltage-activated (-30m/-20V); hanno un’inattivazione molto più lenta. 0 mV 400 pA 30 ms Correnti di Ca HVA -40 mV 100 pA 30 ms Correnti di Ca LVA Poi s’è visto che I canali HVA costituiscono una famiglia comprendente molti membri, che sono stati indicati da lettere (P, Q, R ecc.)

I diversi sottotipi di canali del Ca inattivano in maniera differente a1C (L) a1E (R) a1G (T) 50 ms

Possibile modello di inattivazione VD dei canali del Ca Il linker intracellulare tra i pseudosubunità I e II potrebbe agire da particella inattivante che fisicamente occluderebbe il poro del canale interagendo, almeno in parte, con le regioni S6 dei domini II e III del canale. La subunità b del canale del Ca si associa con il linker tra i domini I-II modificando le proprietà dell’inattivazione; essa potrebbe interagire sia con la subunità a1 che con la membrana.

Possibile modello di inattivazione Ca-dipendente dei canali del Ca Un’elevata concentrazione di Ca intracellulare innesca l’inattivazione dei canali di tipo L. Il sensore per il Ca sarebbe una molecola di calmodulina (CaM). CaM è costitutivamente legata al complesso del canale. L’inattivazione avverrebbe tramite un’interazione Ca-dipendente della CaM legata con un motivo IQ-simile sulla coda carbossilica di a1C. È possibile che un meccanismo analogo intervenga anche a livello dei canali N, P/Q ed R (Peterson, Neuron, 1999). CHIUSO APERTO INATTIVATO Ca2+ Voltaggio The IQ calmodulin-binding motif is an amino acid sequence motif containing the following sequence: [FILV]Qxxx[RK]Gxxx[RK]xx[FILVWY] The term "IQ" refers to the first two amino acids of the motif: isoleucine (commonly) and glutamine (invariably). Nello stato chiuso (iperpolarizzato) l’accesso della CaM alla regione IQ-simile è ridotto. Nello stato aperto (depolarizzato) la CaM legata ha un rapido accesso al dominio IQ-simile. L’accumulo di Ca2+ sulla bocca interna del canale porta all’attivazione Ca-dip. della CaM. L’interazione di CaM-Ca2+ con la regione IQ-simile induce l’inattivazione del canale.

Canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ di tipo L I canali “L” o recettori per le di-idro-piridine (DHP, come la Nifedipina o la nimodipina) hanno un’enorme importanza in Fisiologia. Sono tipici del muscolo scheletrico, ma sono presenti anche nel cuore (*), nella muscolatura liscia e nel sistema nervoso. Hanno un’inattivazione piuttosto lenta, che è anche Ca-dipendente. (*) il bloccante Verapamil viene impiegato nella cura della tachicardia parossitica Altri bloccanti selettivi sono naturalmente quelli appartenenti alle di-idropiridine (nifedipina, nimodipina).

Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo liscio Nel muscolo liscio, il reticolo sarcoplasmatico è praticamente assente. Qui l’attivazione dell’apparato contrattile (non organizzato in sarcomeri) è totalmente dipendente dal Ca2+ che entra attraverso i canali L della membrana plasmatica. Il fenomeno dell’accoppiamento eccitamento  contrazione nei tessuti muscolari illustra bene la doppia importanza dei canali del Ca2+: fanno entrare nella cellula ioni con carica positiva (similmente ai NaV) fanno anche comparire nella cellula un vero e proprio secondo messaggero (gli ioni Ca2+) che ha uno straordinario potere regolatore di molti processi intracellulari

Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo scheletrico Nel muscolo scheletrico, i canali L sono addensati nei tubuli trasversi del reticolo sarcoplasmatico, dove funzionano da “sensori del voltaggio”. Sono accoppiati (con l’ansa di connessione II-III) ad altri canali del Ca2+ presenti nei tubuli longitudinali del ret.sarc., detti “recettori della Ryanodina”. Si attiva così un il rilascio di Ca che attiva con grande rapidità (per feedback positivo) l’apparato contrattile.

Modello per il rilascio voltaggio-dipendente del Ca2+ (muscolo scheletrico) Sensore del volt. Canale di rilascio TT RS A riposo Ca 2+ Vm + - Depolarizzata Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+

Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo cardiaco Accoppiamento EC Cardiaco (Ca2+-induced-Ca2+-release) SR + TT SR TT Vm + + Ca2+ Canale del Ca2+ Canale di rilascio

Ruolo dei canali voltaggio-dipendenti per il Ca nel PdA cardiaco (tessuto di lavoro) Solitamente l’ingresso di Ca2+ attraverso canali VD accompagna (e prolunga) i pda al Na+. E’ il caso delle fibrocellule muscolari scheletriche, ma soprattutto delle fibrocellule muscolari cardiache. Qui l’ingresso di Ca2+ non solo potenzia l’effetto del Na+ nella fase iniziale del pda (depolarizzazione ed overshoot), ma perdura anche quando i canali del Na+ si sono inattivati (l’inattivazione dei canali del Ca2+ c’è, ma è incompleta), dando luogo ad un lungo “plateau”.

Questo lunghissimo “plateau” del pda cardiaco è funzionalmente importante per due buone ragioni: a) il Ca2+ che entra attraverso i canali (L) della membrana plasmatica attiverà il “Ca-induced Ca-release” del reticolo sarcoplasmatico, quindi la contrazione del cuore; b) mantenendo depolarizzata la membrana, la rende ineccitabile per tutta la sua durata (perché mantiene inattivati i canali del Na+). In altre parole: durante il plateau, il cuore si trova in uno stato di refrattarietà assoluta, quindi per tutta la durata della contrazione (della sistole) non può essere nuovamente eccitato. La situazione è molto diversa da quella che si ha nel muscolo scheletrico, nel quale la refrattarietà assoluta termina ancor prima che inizi la contrazione.

Il muscolo scheletrico infatti (per fortuna Il muscolo scheletrico infatti (per fortuna !) è tetanizzabile, cioè le singole “scosse” possono sommarsi tra loro fino alla completa fusione, producendo un aumento della forza contrattile. Di fatto, la maggior parte delle nostre contrazioni sono dei “tetani”. Il cuore invece (per fortuna !) non è “tetanizzabile”: qualunque stimolo “ectopico” è inefficace per tutta la durata della sistole (I), e può produrre una seconda contrazione (“extrasistole”) solo mentre il cuore si sta rilasciando..

Potenziali d’azione al Ca2+ nelle cellule pacemaker cardiache Curiosamente, nel miocardio di conduzione il contributo del Na+ manca non perché i canali del Na+ siano assent:. questi ci sono, ma non entrano in gioco perché sono sempre inattivati (nel tessuto pacemaker, il potenziale di membrana non diviene mai sufficientemente negativo da rimuoverne l’inattivazione). Questi pda al Ca2+ si generano spontaneamente (o meglio, per effetto dell’automatismo tipico del pacemaker), e poi si propagano a tutte le fibrocellule del miocardio di lavoro (che di per sé resterebbero in riposo). Queste, eccitate, genereranno i pda provvisti di “plateau” che abbiamo visto prima.

Interazione tra canali “T” e canali “f” L’esempio del pda (al Ca2+) del pacemaker cardiaco ci offre l’opportunità di parlare di un altro tipo di canali voltaggio-dipendenti: i canali “f” (“funny”), espressi anche in molti neuroni autoritmici del SNC (dove vengono chiamati canali “h”) I canali del Ca2+ di tipo T (e in minor misura L) sostengono il pda, ma per essere attivati necessitano di una depolarizzazione della membrana. Questa, nelle cellule autoritmiche, avviene “spontaneamente” e si chiama prepotenziale. Nel tessuto pacemaker, il prepotenziale (e con esso l’automatismo cardiaco) è generato dall’apertura dei canali-f .

La struttura dei canali HCN I canali HCN sono “canali cationici attivati dall’iperpolarizzazione”. Quando presenti, vengono attivati alla fine di ogni pda, quando la membrana si iperpolarizza. La loro apertura genera una corrente entrante che, depolarizzando la membrana, produce il prepotenziale, e quindi il pda successivo. Ciascuna delle 4 subunità presenta: 6-DTM come i canali Kv S4 riconosciuto come sensore del voltaggio nel C-terminale è presente un dominio CNB come nei canali CNG si pensa che i canali siano formati da TETRAMERI come i canali Kv indietro

Modulazione dei Canali “f” Di grande importanza è la “modulazione” (variazione della sensibilità al voltaggio) dei canali f operata dall’orto- e dal para-simpatico tramite i rispettivi neurotrasmettitori <noradrenalina (+adrenalina) ed acetilcolina>. Modulando i canali f, l’orto- ed il para-simpatico regolano la frequenza cardiaca (!!), come se fossero l’uno l’acceleratore e l’altro il freno di un’automobile. Questi neurotrasmettitori agiscono su recettori accoppiati a proteine-G e fanno rispettivamente aumentare e diminuire il livello intracellulatre di AMPc. I canali f sono voltaggio-dipendenti, ma anche chemio-dipendenti (dal versante intracellulare), una condizione tutt’altro che infrequente.

Correnti T neuronali e spikes al Ca2+ Vhold-90 mV

Vedi registrazione Attività ritmica spontanea in un neurone talamico Attività oscillatoria -65 mV 1 s Bursts di PdA dovuti all’interazione della corrente di Ca2+ IT con la corrente pacemaker cationica entrante Ih -65 mV ------ PdA al Na+ Spike al Ca 2+ attivazione Ih attivazione IT deattivazione Ih inattivazione IT rimozione Potenziale pacemaker Vedi registrazione Quale meccanismo innesca questa attività autoritmica?

- TALAMO CORTECCIA + NRT GABA GLUT CORTECCIA NUCLEI di RELAY TALAMO NRT afferenze talamiche Il neurone GABAergico determina sul neurone del nucleo di relay un PPSI che genera iperpolarizzazione e fa aprire i canali “h” innescando l’attività autoritmica in tali neuroni NRT: nucleo reticolare del talamo

La genesi di un burst di pda in un singolo neurone del nucleo reticolare del talamo (NRT) può generare un IPSP nelle cellule talamocorticali del nucleo di relay che è sufficientemente ampio da generare uno spike al Ca2+ e un burst di pda. Ampiezza e andamento temporale dell’IPSP generato nel neurone talamocorticale del nucleo di relay dipendono fortemente dal tipo di scarica generata a livello del NRT, e viceversa.

Canali P e spikes complessi nelle cellule del Purkinje Un’unica fibra rampicante contatta un’unica cellula del Purkinje formando molte sinapsi. Ciascun singolo input genera una rapida scarica di potenziali d’azione di latenza e durata brevi (spikes complessi: azione fasica rapida). Apertura di canali del Na+ Spikes complessi: sono generati a frequenze basse (1-3 Hz), e caratterizzati da uno spike iniziale prolungato di ampiezza elevata, seguito da un burst ad alta frequenza di potenziali d’azione di ampiezza minore. Sono generati dall’attivazione delle fibre rampicanti e coinvolgono la genesi di potenziale d’azione al Ca2+ nei dendriti (P-type): l’apertura dei canali del Ca P-type genera una depolarizzazione (potenziale di plateau) che a sua volta permette l’apertura di canali Na convenzionali generando un breve burst. In seguito all’attività degli spikes complessi, gli spikes semplici possono essere soppressi dal potente input dello spike complesso. Il significato fisiologico degli spikes complessi, se si ipotizza che le fibre rampicanti portano informazioni circa un errore nell’esecuzione di un movimento, potrebbe essere che gli spikes complessi, silenziando il “regular spiking” (spikes semplici), dicano: attenzione! c’è un errore, occorre risettare il sistema. Silenziamento della cellula del Purkinje (PC) dopo lo S. complesso: 1) inattivazione dei canali del Na dovuta allo scontro tra spikes semplici e complessi; 2) attivazione di una conduttanza al K Ca-attivata che iperpolarizza la membrana e allontana la cellula dalla soglia di eccitamento. La liberazione di Glu dalle fibre parallele attiva nei dendriti delle PCs dei mGluRs che tramite la PLC aumentano la [IP3]. L’IP3 libera Ca2+ dagli stores intracellulari. L’aumento della [Ca] intracellulare dovuto a questo evento e contemporaneamente all’apertura dei canali P-type, causa una attivazione della PKC che a sua volta fosforila i recettori AMPA del terminale postsinaptico, favorendone l’internalizzazione. La riduzione dei recettori AMPA avrebbe come conseguenza l’instaurarsi della depressione a lungo termine (LTD) nella PC con conseguente lungo silenziamento. Purkinje cells show spontaneous electrophysiological activity in the form of trains of spikes both sodium-dependent and calcium-dependent. This was initially shown by Rodolfo Llinas (Llinas and Hess (1977) and Llinas and Sugimori (1980). P-type calcium channels were named after Purkinje cells, where they were initially encountered (Llinas et al. 1989), which are crucial in cerebellar function. We now know that activation of the Purkinje cell by climbing fibers can shift its activity from a quiet state to a spontaneously active state and vice-versa, serving as a kind of toggle switch (Loewenstein et al., 2005, Nature Neuroscience). However, these findings have recently been challenged by a study suggesting that such toggling by climbing-fiber inputs occurs predominantly in anaesthetized animals and that Purkinje cells in awake behaving animals, in general, operate almost continuously in the upstate (Schonewille et al., 2006, Nature Neuroscience). Apertura di canali del Ca2+ P-type Gli spikes complessi sono spesso seguiti da una pausa di alcune centinaia di msec durante la quale l’attività degli spikes semplici è soppressa.

Canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ di tipo N e P/Q nell’esocitosi Un altro esempio di enorme importanza funzionale è l’ “esocitosi regolata” di vescicole (v. rilascio di insulina: qui sono implicati canali del Ca2+ di tipo L ) in tutte le cellule secernenti. Un caso particolarissimo di “esocitosi regolata” è la liberazione di vescicole contenenti neurotrasmettitore nella trasmissione sinaptica. Qui operano canali “N” (per neuronal, bloccati dall’ ω-Conotossina), che sono esclusivi del SN, ma anche canali “P/Q” (bloccati dall’ ω-Agatossina) ed R, per i quali non è noto alcun bloccante specifico.

La trasmissione sinaptica La combinazione del neurotrasmettitore con i propri recettori presenti nella membrana postsinaptica consentirà la trasmissione sinaptica (una depolarizzazione [EPSP] nelle sinapsi eccitatorie o un’ iperpolarizzazione [IPSP] nelle sinapsi inibitorie…)

Eventi pre-simnaptici I canali N e/o P/Q sono addensati nelle terminazioni presinaptiche, dove sono essenziali per il rilascio di neurotrasmettitore. In particolare sono presenti al centro delle zone attive alle quali sono ancorate le vescicole sinaptiche pronte al rilascio (“pool” di rilascio). Le zone attive sono formazioni del citoscheletro altamente ordinate, visibili dal versante citoplasmatico della membrana presinaptica). In corrispondenza delle zone attive, i lipidi della membrana sono organizzati a formare dei “rafts” (zattere). L’arrivo del pda e la conseguente depolarizzazione della membrana presinaptica apre i canali del Ca2+ …. …. ed il Ca2+ fa scattare un complesso sistema di controllo. La fusione delle vescicole promossa dal Ca2+ è preceduta da fasi preliminari:

Si distinguono tre fasi che portano alla liberazione del neurotrasmettitore “Docking” (attracco) … B) “Priming” (preparazione) … C) “Fusione”. All’arrivo del pda si ha la fusione Ca-dipendente, (preceduta dalla formazione di un poro attraverso il quale passerà il neurotrasmettitore), che consente l’esocitosi delle vescicole ancorate alle zone attive (“pool di rilascio”).

Ruolo dei canali del Ca2+ al di fuori delle zone attive della membrana pre-sinaptica Canali VD per il Ca2+ (solitamente del tipo L) sono anche presenti nella membrana presinaptica al di fuori delle zone attive (A). La loro attivazione (B) serve a distaccare le vescicole del “pool di deposito” dai filamenti di actina del citoscheletro, quindi a rifornire il “pool di rilascio”. Lo schema C illustra il processo in maggior dettaglio. Anche in questo caso si mette bene in evidenza il ruolo del Ca2+ come secondo messaggero intracellulare !