DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI CINETICI DEGLI ENZIMI - Vmax E Km Saggio enzimatico in saturazione di S: V0 = K2 [ET] permette di ottenere le U di attività catalitica relative ad un enzima in un campione biologico: U.E. dipendenti direttamente dalla concentrazione di E totale presente; Determinazione dei parametri cinetici di un enzima: Vmax e Km: fondamentale in biochimica applicata – Km: indice di affinità dell’enzima per il suo substrato; Vmax: massima velocità alla [Et] data; studio di inibitori e regolatori enzimatici; identificazione di isoenzimi; consente di «seguire» le tappe di purificazione di un enzima. Le applicazioni dello studio degli enzimi, oltre ad essere basilari nella ricerca fondamentale biochimica, hanno importanti ricadute in diagnostica clinica e in farmacologia.

Sono lo «strumento» principe attraverso il quale si realizzano: ENZIMI Gli enzimi sono i biocatalizzatori delle reazioni chimiche all’interno delle cellule. Sono lo «strumento» principe attraverso il quale si realizzano: metabolismo energetico, biotrasformazioni o processi fondamentali della vita cellulare quali duplicazione del DNA, trascrizione dell’RNA e sintesi proteica. Sono macromolecole biologiche, proteine. Eccezione: i ribozimi, particolari RNA con attività catalitica nelle cellule. Ipotesi interessante: RNA, prime molecole con funzione di catalizzatori biologici, sostituite dalle proteine, strutturalmente più adatte ad esplicare questa funzione: RNA PROTEINE Enzimi proteici: proteine a singola catena polipeptidica; proteine con struttura quaternaria; isoenzimi (ex. LDH) con diversa localizzazione nei tessuti o a livello sub-cellulare Parte proteica apoenzima + parte non proteica oloenzima Parte non proteica: Gruppi prostetici: ex: eme nel Citocromo P450; Coenzimi, Cofattori inorganici: metalli, (Zn, Mg, Cu, Fe..) in metalloenzimi

PROPRIETA’ DEGLI ENZIMI VELOCITÀ DELLE REAZIONI: enzimi aumentano la velocità di reazione fino a 108-1012 volte la velocità in assenza del catalizzatore. Reagente/i = substrato/i. SPECIFICITA’: Specificità degli enzimi è un criterio di classificazione: enzimi a specificità verso il substrato assoluta (una molecola unica); di tipo stereochimico (riconoscimento degli stereoisomeri); di gruppo (gruppo chimico; ex. metiltransferasi); di legame (un legame chimico, ex. proteasi, legame peptidico). REGOLAZIONE: gli enzimi sono soggetti a regolazione per adattare l’attività catalitica alle necessità fisiologiche e ai cambiamenti che si attuano nelle cellule. inibizione a feed-back, inibizione da substrato o prodotto, fosforilazione reversibile, induzione e regolazione dell’espressione genica. Siti di regolazione - modulazione allosterica: siti di legame con molecole che modulano l’attività enzimatica. Struttura quaternaria e reg. allosterica. DOMINI E PORZIONI DELLE PROTEINE CON FUNZIONE DI ENZIMA: Sito attivo o catalitico: “tasca” catalitica, dominio dell’enzima che riconosce il substrato e si lega reversibilmente con questo, formando ES. Nel sito catalitico si trovano alcuni residui di AA che sono coinvolti nel meccanismo di catalisi grazie alla natura chimica dei loro gruppi –R. Complementarietà e/o adattamento sterico tra E e S. La conformazione 3D del sito attivo – struttura 3D di tutta la molecola.

MECCANISMO DI INTERAZIONE ENZIMA-SUBSTRATO

CONSIDERAZIONI ENERGETICHE E CINETICHE Termodinamica chimica: E libera G di reazione, G(P) –G(R) = G G = H – TS G < 0, reazione esoergonica, spontanea da sinistra vs. destra; G > 0, reazione endoergonica, spontanea da destra vs. sinistra; G = 0, all’equilibrio nei due sensi. G0’: variazione di E libera standard, 1 M, a pH 7, Kcal mole-1 A + B C + D reazioni reversibili G = - RT ln Keq + RT ln ([C] [D]/[A] [B]) G0’ = - RT ln Keq , a pH 7 La spontaneità di una reazione chimica o della direzione di un equilibrio chimico dai reagenti ai prodotti e viceversa non ci dice però niente sulla cinetica e la velocità della reazione stessa. E di attivazione: soglia energetica di una reazione chimica; Coordinate di reazione: percorsi e distanza delle specie chimiche in gioco ; Equazione di Arrhenius : k = A e-Ea/RT A= fattore di frequenza, geometria delle molecole; K = cost. di velocità della reazione o vel. specifica di reazione R= costante universale dei gas T= temperatura in Kelvin

chimica con e senza l’enzima Teoria dello stato di transizione Tanto minore è E att., tanto più la reazione raggiunge facilmente lo stato di transizione e può procedere più velocemente nel verso termodinamicamente favorito. Quindi: una reazione può procedere o avvenire + veloc. non per il G tra R e P ma per il valore di Eatt. Anche nella cellula valgono tali principi - le reazioni intracellulari – isobare e isoterme – anche se hanno un G neg. procederebbero comunque troppo lentamente; le reaz reversibili non potrebbero andare in una direzione o in un’altra prontamente per rispondere alle esigenze cellulari: gli enzimi svolgono questa funzione. E(att.) di una reazione chimica con e senza l’enzima Un enzima: accelera la reazione; non è né un R né un P; -non viene consumato durante la reaz.; -non sposta l’equilibrio di reaz.; -non modifica il G complessivo R vs. P è presente in quantità minime, non stechiometriche.

Cinetica in stato stazionario: si vede CINETICA ENZIMATICA Le reazioni del metabolismo energetico possono essere spontanee o meno e, se sono reversibili, avvengono in un verso o l’altro in base alle concentrazioni dei reagenti o dei prodotti. Gli enzimi abbassano l’Eatt. delle reazioni senza modificare la direzione della reazione, la necessità o meno di consumo energetico e gli equilibri. k1 Dalla cinetica chimica: S P Vf = k1 [R], senza enzima K-1 E + S k1 K-1 ES E + P K2 =Kcat. K-2 Eq. Henri-Brown Cinetica in stato stazionario: si vede come varia la vel. enzimatica a varie [S]; approccio semplificato per studiare la cinetica delle reazioni catalizzate da E; assunzioni teoriche: - [E] << [S] - velocità iniziale, V0: - Stato stazionario: [ES] = k K1[E] [S] = k-1 [ES] v0 Alle condiz. fissate di: temperatura, pH, forza ionica, alla v0, la pendenza della tangente alla curva [S] dt dip. da [ET ].

Iperbole di Michaelis & Menten Vmax= K2[Et] V0 = k2 [ET] [S] Km + [S] La V0 dipende da: [E], [S] e Km b) V0 = K2 [ET] 1) Per [S] << Km la V0 dipende da [S] e [Et]: V0 = (Vmax/ [S])/Km Reazione che segue una cinetica del 1° ordine; a) V0 = k2[ET] [S] Km Situazioni limite: [S] molto basse, Lim [S] 0 b) [S] verso la saturazione - 2) Per [S] = Km , V0 = Vmax/2 Km = K-1 + K2/ K+1 V0 = k2[ET]/2 Reazione che dipende da [S] = Km dell’ E in gioco e da [ET] V0= K - 3) Per [S] >> Km, V0 = Vmax, reazione di ordine cinetico = 0 La V0 dipende solo da [ET]

∫ ∫ CINETICA DEL 1° ORDINE Situazione limite a) 1° tratto della M & M Esempi generici - dS/dt = K [S], retta, Quando S << Km [S] scompare nel tempo secondo una curva esponenziale: integrando - dS/dt= k [S]: [A] = A0e-kt ∫ A0 [A] - d[A]/[A] = kdt t CINETICA DI ORDINE 0 Situazione limite b) in saturazione [A] [A]=A0 -kt dS/dt= K [S] scompare nel tempo secondo una retta con pendenza –k integrando - dS/dt= k ∫ A0 [A] - d[A] = kdt t tempo

Linearizzazione iperbole di Michaelis- Menten L’iperbole si può linearizzare, rendendo l’analisi dell’attività E più immediata e di più facile gestione pendenza Altre linearizzazioni: Hanes-Woolf; Eadie-Hofstee

Vmax e Km ADENOSINA DEAMINASI + H2O + NH3 idrolasi Inosina Adenosina Come si realizza in vitro il saggio di determinazione dei parametri cinetici di questa trasformazione Esistono diverse metodiche per determinare la velocità enzimatica di questa deaminasi – saggio spettrofotometrico: Abs 260/265 nm. A 260nm si misura l’Abs dell’adenosina; la velocità V0 dell’adenosina deaminasi, ovvero l’ estinzione a tempo iniziale dell’adenosina per effetto della trasformazione enzimatica in inosina, si misura invece a 265nm. Questo viene fatto per eliminare l’interferenza del prodotto, l’inosina, che assorbe a 260 ma non a 265 nm.

a) Verifica concentrazione delle soluzioni preparate di adenosina: ESPERIMENTO: Vmax e Km dell’enzima Adenosina Deaminasi con metodo spettrofotometrico UV Si determina la V0 a varie concentrazioni di Substrato (adenosina), scelte al di sotto e al di sopra della Km attesa (~40 mM): le concentrazioni di adenosina sono comprese tra 5 e 80 mM. S1: 5 mM S2: 10 mM Soluzione stock di partenza Adenosina 300 mM diluizioni S3: 20 mM S4: 40 mM S5: 60 mM S6: 80 mM a) Verifica concentrazione delle soluzioni preparate di adenosina: Spettrofotometro: si legge a 260 nm (UV) per verificare [Adenosina] mediante la e, coeff. di estinzione mmolare dell’adenosina = 0.015. A260nm/0.015= conc mM b) Calcolo della V0 dell’adenosina deaminasi: Si sposta la l di lettura da 260 a 265 nm e si aggiunge l’enzima Adenosina Deaminasi (opportunamente diluito) alle soluzioni di adenosina preparate : + Adenosina Deaminasi Reazione: Adenosina Inosina In sostanza: per ogni soluzione di adenosina, si calcola la V0: -dS/dt, DA/min, in 2 min d’intervallo di tempo: lo strumento misura l’Abs a 265nm ogni 10 sec in 2 min. DA nel tratto lineare: A(iniziale) – A(finale) sulla retta tangente alla curva di estinzione di A in funzione di t: si rapporta al min (DA/min). Diluendo opportunamente l’E, il tratto sarà lineare nei 2 min.