Equilibrio tra le fasi Dc = C1/C2, dove C indica la somma della concentrazione delle varie forme in cui può essere presente la sostanza che si ripartisce tra le fasi. Equilibrio prima dopo FASE 1 FASE2 Concentrazione 0 C1 Volume V1 V1 Concentrazione C0 C2 Volume V2 V2 FASE 1 FASE 2

p = frazione di soluto nella fase 1 = q = frazione di soluto nella fase 2 = C0 V2 = C1 V1+ C2 V2 Dividendo per C2V2 numeratore e denominatore, poiché C1/C2 = Dc e V1/V2 = Vr si ha: C1 V1/C2V2/C1V1+C2V2/C2V2 p = C2V2/C2V2/C1V1+C2V2/C2V2 q =

n=0 n=1 Le frazioni di soluto nei recipienti dopo l’equilibrio sono i termini individuali dell’espressione (q+p)n n=2 Se indichiamo con (Fr,n) la frazione di soluto contenuta in r dopo n trasferimenti abbiamo: n=3 n=4 r=0 r=1 r=2 r=3

È possibile dimostrare, matematicamente, che rmax Il calcolo di F mediante l’espressione fattoriale diventa particolarmente lungo quando n ed r diventano grandi. Fortunatamente, in queste condizioni, la distribuzione binomiale può essere approssimata ad una distribuzione normale (gaussiana) che ha la forma: 2 f(x) = Ae−B(x−x0) Per n>24

Separazione di due soluti (Dc1 =3, Dc2=1/3) per n=25 ed n=100

Lyman C. Craig (1906-1974) A manual version of Lyman C. Craig's CCD machine designed by Erich Hecker

TEORIA DEL PIATTO relazione con la distribuzione in controcorrente In cromatografia sia r che n sono molto grandi, ma n>> r, per cui Applicando l’approssimazione di Stirling

La frazione di ogni soluto sarà distribuita entro un certo numero di recipienti (piatti teorici) specificato dalla precedente equazione. Se vogliamo calcolare la frazione di soluto per rmax (massimo del picco), ricordando che rmax = np si ha Consideriamo la situazione in cui il soluto costituito da m moli totali, e la sua massima concentrazione si trovi in rmax = N, avremo che la quantità totale Q nel recipiente rmax = N sarà

Il soluto si muove lungo la colonna di N piatti in un tempo =tR (tempo impiegato dal massimo della concentrazione ad uscire dalla colonna), per cui la velocità di uscita espressa come piatti/tempo sarà N/tR e la velocità della massima quantità Smax sarà

La quantità m è proporzionale all’area del picco, mentre la velocità del massimo di concentrazione di uscita (massimo del picco) è proporzionale alla sua altezza. considerando in prima approssimazione il picco triangolare ed esprimendo l’altezza in unità arbitrarie e la base in unità di tempo avremo A questo punto possiamo rimpiazzare l’approssimazione del picco triangolare ed esprimere la formula più correttamente considerando il picco gaussiano N = 16(tR/tw )2 (tw = 4τ), dove τ è la deviazione standard espressa in unità di tempo, quindi N = (4tR 4τ )2

Piatti teorici Per descrivere il processo cromatografico è utilizzata una similitudine derivante dalla teoria della distillazione e dell’estrazione in controcorrente. Il sistema cromatografico è immaginato simile ad una colonna di distillazione, cioè composta da una serie di strati sottili chiamati piatti teorici; in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza l’equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile. Lo spostamento del soluto lungo la colonna è dovuto all’azione dinamica della fase mobile I termini numero di piatti teorici (N) e altezza del piatto (HETP, Height Equivalent to Theoric Plate) sono comunemente utilizzati in cromatografia per quantificare le prestazioni dei sistemi cromatografici Il numero di piatti teorici rappresenta l’efficienza separativa totale della colonna, mentre HETP, che è = N/L. dove L è la lunghezza della colonna, rappresenta l’efficienza specifica.

Altezza equivalente di piatto teorico H Numero di piatti teorici N L = lunghezza colonna Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di scambio di materia in condizioni di non-equilibrio, dovuto al continuo fluire della fase mobile, N ha un significato puramente matematico. Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna. W L’altezza equivalente al piatto teorico (H = L/N) consente di confrontare l’efficienza di colonne di differente lunghezza.

w½= 2.35σ

W

LIMITI DELLA TEORIA DEL PIATTO K è costante ed indipendente dalla concentrazione del soluto L’equilibrio è rapido rispetto alla velocità della fase mobile Non c’è diffusione longitudinale del soluto (recipienti con pareti) La fase mobile è aggiunta per incrementi e non in continuo.

DI queste assunzioni solo la prima è valida nella cromatografia analitica ed è mantenuta nella teoria dinamica che risulta anche essa valida solo per la cromatografia con isoterma di ripartizione lineare I piatti nella colonna non esistono, sono una approssimazione e non una realtà fisica, l’equilibrio non è istantaneo e la diffusione avviene lungo tutta la colonna, mentre il passaggio da una fase all’altra avviene senza che l’equilibrio sia stabilito. Infine, la larghezza del picco dipende dalla velocità con cui la fase mobile fluisce lungo la colonna.

I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono: Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media. I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono: diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela all’asse della colonna); percorsi multipli; trasferimento di massa tra fase mobile e fase stazionaria.

La molteplicità dei cammini che le molecole possono percorrere provoca un allargamento della banda di eluizione

Re = d/Dv d= diametro del tubo Dv = diffusività cinematica. <2300 regime laminare >2300<4000 regime di transizione >4000 regime turbolento

LA TRATTAZIONE FISICA DI QUESTI FENOMENI HA DATO ORIGINE ALLA TEORIA DINAMICA

Hmd = 2γm Dm /u ; Hsd = 2k’γs Ds /u TEORIA DINAMICA σ2 = Σσj2 H = ΣHj Diffusione longitudinale σmd = (2γm Dm t)½ Ricordando che * N = tR 2/σt2 = L2/ σL2 ; H = L/N = σL2/L e t/L =1/u Hmd = 2γm Dm /u ; Hsd = 2k’γs Ds /u Dove γ è il fattore di ostruzione, D il coefficiente di interdiffusione e u la velocità lineare

MOLTEPLICITA DEI CAMMINI Detta anche “eddy diffusion” Hfed = 2 λ dp λ è una misura della non eguaglianza dei flussi vale solo per le colonne impaccate

TRASFERIMENTO DI MASSA Colonne impaccate Nella fase mobile Hmfd = ω dp2 u/Dm ω = fattore di impaccamento dp = diametro delle particelle Nella fase stazionaria Hsfd = 2/3(2k’/[1+k’]2) (df2/Ds) u df = spessore del film di fase stazionaria Colonne tubolari Nella fase mobile Hmfd = (1+6k’+11k’2)dt2u/96(1+k’)2Dm dt = diametro del tubo Nella fase stazionaria la formula è come per le impaccate

Equazione di Van Deemter L’equazione che meglio riproduce i dati sperimentali è la combinazione di tre equazioni che esprimono i tre fenomeni diffusivi H = A + B/u + Cmu + Cs u

The concept of reduced plate height (h ) and reduced velocity  (ν) was introduced in an attempt to form a basis for the comparison of different columns packed with particles of different diameter. In fact, the reduced plate height merely measures the plate height in units of particle diameters. The reduced plate height is dimensionless. The reduced velocity compares the mobile phase velocity with the velocity of the solute diffusion through the pores of the particle. In fact, the mobile phase velocity is measured in units of the intraparticle diffusion velocity. As the reduced velocity is a ratio of velocities, like the reduced plate height, it also is dimensionless. It should be noted that the constants of the equation were arrived at by a curve fitting procedure and not derived theoretically from a basic dispersion model; as a consequence the Knox equation has limited use in column design. It is, however, extremely valuable in accessing the quality of the packing

L’equazione di Giddings modifica l’equazione di Van Deemter

Sources of Extra Column Dispersion

Risoluzione cromatografica La possibilità di separare due o più sostanze è descritta dal parametro detto risoluzione, che misura la capacità di un sistema cromatografico di separare due analiti che hanno tR simili. Essa viene definita: R = [(tR)B - (tR)a]/(Wa+Wb/2 ovvero Se la risoluzione non è sufficiente (R < 1), i due picchi non possono essere quantificati in maniera corretta La risoluzione misura l’entità della separazione, che sarà tanto maggioore quanto più distanti sono le velocità di migrazione (il tempo, a parità di lunghezza della colonna) e quanto più strette sono le bande di migrazione.

Risoluzione cromatografica Ricordando che N = 16(tR/tw )2 N½ = 4 tR/tw esprimendo in termini di lunghezza si ha: W = 4 tR/ N½ da cui: R = 2[(tR)B - (tR)a]/(tR)B + (tR)a /4N½ = ½N½ (tR)B - (tR)a/(tR)B + (tR)a ricordando che k’ = tR-tm/tm = (tR/tm)-1; tR = (k’+1)/tm sostituendo si ha R = ½N½ (k’b+1)-(k’a+1)/tm / (k’b+1)+(k’a+1)/tm Semplificando e dividendo per k’a otteniamo R = ½N½ (k’b/k’a)-1 / (k’b/k’a)+1+(2/k’a); k’b/k’a =α (fattore di selettività) quindi R = ½N½ α-1/α+1+2/k’a Questa equazione non è di facile soluzione, ma per k’b~k’a, una soluzione approssimata è R = ¼N½ α-1/α x k’b/ k’b+1

buona risoluzione dovuta a buona efficienza α= k’B/ k’A Effetto della selettività, dell’efficienza e del fattore di capacità sulla risoluzione risoluzione scarsa picchi non separati buona risoluzione dovuta a buona efficienza picchi stretti L’equazione approssimata della risoluzione può essere facilmente derivata da considerazioni di carattere geometrico e considerando WA = WB buona risoluzione dovuta a buona selettività picchi distanti risoluzione scarsa dovuta ad un basso fattore di capacità

Risoluzione e separazione

Capacità di picco

Peak capacity

Si può calcolare il valore di k’ nell’eluizione in gradiente? È possibile calcolare in modo approssimato un valore di k’ medio in cromatografia liquida con la seguente formula k’m=1/1.15b b =tGF /Vm∆φS tG = tempo del gradiente F = portata Vm =Volume morto ∆φ = variazione della % di solvente forte S= d(logk’)/d φ

ELUIZIONE IN GRADIENTE