MARCATORI POLIMORFICI DEL DNA Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) (Studi di associazione) Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Minisatelliti (Diagnostica forense) Microsatelliti (Studi di associazione e diagnostica forense) Single Nucleotide Polymorphism (SNP) (Studi di associazione anche per caratteri quantitativi)

Enzimi di restrizione 1) Sequenza di riconoscimento (da 4 a 8 basi) detta palindrome: rispetto ad un asse di simmetria esiste la stessa sequenza di basi su entrambi i filamenti quando questi vengono letti in direzione 5’- 3’; 2) Sporgenze al 5’ o al 3’; 3) Estremità coesive o non coesive; 4) Isoschizomeri (enzimi diversi che riconoscono la stessa sequenza); 5) Enzimi con sequenze di riconoscimento diverse ma che creano estremità compatibili (isoschizomeri) (es: BamHI e MboI).

Enzimi di restrizione

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Polimorfismo per lunghezza di frammenti di restrizione

Identificazione di RFLP attraverso Southern blot Digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione 2. Separazione dei frammenti per elettroforesi su agarosio 3. Immobilizzazione DNA con trasferimento su membrana 4. Ibridazione con sonda marcata 5. Identificazione dell’ RLFP

Identificazione di RFLP attraverso Southern blot

Identificazione del peso molecolare delle bande dopo corsa elettroforetica DNA I: 19 mm = ~ 6,5 Kb 37 mm = ~ 1,2 kb DNA II: 20 mm = ~ 5 Kb 35 mm = ~ 1,6 kb

Identificazione di RFLP dopo corsa elettroforetica 3B 5B 7B B E 3 1 5 Dimensioni bande Non digerito: 15 kb EcoRI: 4, 5, 6 kb BamHI: 3, 5, 7 kb EcoRI + BamHI: 1, 3, 5 kb

Southern blot, Northern, Western …

Identificazione dell’allele S per la falcemia attraverso un RFLP nel gene beta della globina: quando la mutazione altera il sito di restrizione

Identificazione della segregazione di un allele patologico attraverso un RFLP quando la mutazione altera il sito di restrizione

Identificazione della segregazione di un allele patologico in una malattia mendeliana attraverso l’associazione con un RFLP

MINISATELLITI Sequenze ripetitive ipervariabili disperse nel genoma principalmente nei telomeri (9-64 bp in blocchi da 0,1 a 20 kb). Variabilità inter-individuale dovuta al numero di ripetizioni in tandem Un locus Un altro locus 1 2 3 Esempio: Sequenza di minisatellite: GGGCAGGAXC (core) simile alla sequenza “chi” di E. coli, segnale per la ricombinazione generalizzata

Uso del fingerprint del DNA per scopi medico-legali (minisatelliti di Jeffreys) (A) test di paternità (B) test per casi di violenza sessuale

VNTR: MICROSATELLITI o STR (SHORT TANDEM REPEATS) Simple Tandem Repeats (1-5 bp) disperse nel genoma (blocchi inferiori a 100 bp) Variabilità inter-individuale per numero di ripetizioni in tandem

ESEMPIO DI ALLELI DI UN LOCUS MICROSATELLITE NEL GENOMA Nel genoma umano ci sono circa: 130.000 STR dinucleotidici 8.700 STR trinucleotidici 23.700 STR tetranucleotidici 4.300 STR pentanlucleotidici 230 STR esanucleotidici

Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide

Eredità di un locus microsatellite in una famiglia

Tre loci microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore Marcatura di un primer di ogni PCR con diverso fluoroforo

Microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore Prodotti di ogni singola PCR marcati con coloranti fluorescenti

Microsatelliti analizzati con sequenziatore Tutti gli alleli noti per ogni locus microsatellite marcati con fluorofori

Fingerprinting genetico mediante loci microsatelliti

Fingerprinting genetico mediante loci microsatelliti 1 sbagliato!

IDENTIFICAZIONE DEL SESSO MEDIANTE PCR Y-SPECIFICA

MAPPA CROMOSOMICA DEI GENI AmelX E AmelY Amelogenina: proteina presente nello smalto dei denti Primo esone del gene AmelY (pseudogene) più lungo di 6 basi rispetto al gene AmelX. Nel maschio: due bande di 106bp (AmelX) e 112bp (AmelY). Nella femmina: due bande sovrapposte di 106bp (AmelX).

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Solitamente 2 alleli Frequenti nel genoma (1 ogni kb) Tasso mutazione: ca 10-9 Tipizzazione con procedura sequenziamento automatizzato 1000 Genomes Project: identificati oltre 11 milioni di SNP in sequenze codificanti

Coppia di cromosomi omologhi Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Esempio: un soggetto eterozigote C/T Coppia di cromosomi omologhi In quella particolare posizione del genoma (locus) gli individui possono essere classificati con 3 possibili genotipi: omozigoti C/C, omozigoti T/T, o eterozigoti C/T

Analisi di SNP per lo studio delle relazioni evolutive

APLOTIPO Specifica combinazione di due o più alleli di marcatori del DNA situati vicino l’uno all’altro sulla stessa molecola di DNA. I polimorfismi per singolo nucleotide (SNP) sono i marcatori più frequenti utilizzati per costruire aplotipi. Gli aplotipi si generano per caso quando una serie di mutazioni strettamente associate si accumulano nel corso del tempo in cromosomi discendenti da un cromosoma ancestrale

Analisi della combinazione di SNP adiacenti: l’aplotipo Individuo 1 Individuo 2 Specifica combinazione di due o più alleli SNP situati vicino l’uno all’altro sulla stessa molecola di DNA. Gli SNP sono i marcatori polimorfici più frequenti utilizzati per costruire aplotipi. Gli aplotipi si generano per caso quando una serie di mutazioni strettamente associate si accumulano nel corso del tempo in cromosomi discendenti da un cromosoma ancestrale

Formazione di aplotipi nel corso di un tempo evolutivo Comparsa di 2 mutazioni Comparsa di 3 mutazioni Diversi tra loro per 5 SNP

APLOTIPO 1 2 3 1 2 3 4 Locus genico Alleli RFLP +/- +/- +/- Alleli SNP introne esone 3’ UTR Locus genico Alleli RFLP +/- +/- +/- Alleli SNP C/T A/G C/T Popolazione A Aplotipi RFLP Aplotipi SNP + + - 1 + + 2 + 3 + - - 1 C G C 2 T G C 3 T A C 4 C A C

MAPPATURA RISPETTO AD APLOTIPO CON MARCATORI MICROSATELLITI DEL DNA Possibile localizzazione gene malattia Rispetto ai marcatori sul braccio lungo del cromosoma, il gene patologico mappa prossimalmente rispetto a S129.