Funzione del gene:dal gene alla proteina

Le varie classi di RNA RNA (acido ribonucleico): catena di ribonucleotidi, chimicamente molto simile al DNA Di solito a singolo filamento (anche appaiamenti intramolecolari), anche se esistono esempi di RNA a doppia elica Rispetto al DNA sono presenti lo zucchero ribosio al posto del desossiribosio e l’Uracile al posto della Timina

Come si è dimostrato che l’informazione si trasferisce dal DNA all’RNA mediante il processo della trascrizione?

Dove viene sintetizzato l’RNA? Esperimenti di somministrazione di uridina triziata a cellule in coltura. La radioattività è presente inizialmente nei nuclei delle cellule e più tardi anche nel citoplasma. Ipotesi 1: l'RNA è sintetizzato nel nucleo e poi trasportato nel citoplasma. Ipotesi 2: l'RNA viene sintetizzato in entrambe le localizzazioni, ma con una velocità maggiore nel nucleo. In che modo distinguere tra le due ipotesi?

Dove viene sintetizzato l’RNA? Trapianto di nuclei in Amoeba, Lester and Walter Plaut, 1955 Crescita in terreno con uridina triziata per marcare l’RNA; Trapianto di nucleo in un donatore cresciuto in terreno privo di uridina triziata (con 3H) Fissaggio a vari tempi Esposizione dei campioni per ottenere autoradiografie Localizzazione segnale Inizialmente tutta la radioattività viene rilevata all'interno del nucleo trapiantato (Figure 1A, B); Successivamente, la radioattività è rilevata nel citoplasma delal cellula che ha ricevuto il nucleo (figure 2A, B). La radioattività si era quindi spostata dal nucleo al citoplasma, suggerendo fortemente un'origine nucleare dell'RNA. Goldstein, L., & Plaut, W. Evidence for nuclear synthesis of cytoplasmic ribose nucleic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences 41, 874–880 (1955).

Dal DNA all’RNA: il trasferimento dell’informazione genetica

Gli sperimenti sul fago Astrachan e Volkin 1956, 1958: Infettano E. coli con fago T2, usando la marcatura con p32 e osservano una improvvisa sintesi di RNA. La composizione in basi dell’RNA di nuova sintesi prodotto in seguito all’infezione di E. coli è simile a quella del DNA fagico e non a quella del batterio Spiegelman, 1961: Ipotizzò che l’RNA fosse complementare a uno dei due filamenti di DNA del fago. In collaborazione con Hall e Nomura, Infettò E. coli con il fago T2, isolò l’RNA marcato con p32 prodotto dopo l’infezione, lo ibridò col DNA denaturato del fago e di E. coli separatamente. Solo utilizzando il DNA del fago si ottenevano molecole ibride DNA/RNA. Conclusione: Il DNA del fago veniva copiato in un RNA complementare In seguito Spiegelman isolò la RNA replicasi (RNA polimerasi) dal fago a RNA Q-beta e fu in grado di sintetizzare in vitro molecole di RNA del batteriofago

La visualizzazione delle trascrizione dei geni ribosomali negli oociti di Xenopus: gli alberi di Natale Oscar Miller, Barbara Hamkalo e Charles Thomas (1970) Trattando con DNAsi veniva eliminato il “tronco”, mentre trattando con RNAsi erano disgregati i rami laterali Conclusione: il tronco corrisponde al DNA stampo e i rami laterali rappresentavano le molecole di RNA in fase di sintesi

La trascrizione: siti promotori e terminatori I promotori sono sequenze a monte dei geni che definiscono il sito di inizio della trascrizione. I terminatori indicano il sito di fine della trascrizione

La trascrizione: le RNA polimerasi Nei procarioti esiste solo una RNA polimerasi che trascrive tutti i geni Negli eucarioti ci sono 3 diverse RNA polimerasi: RNA polimerasi I per la sintesi dell’RNA ribosomale (rRNA) RNA polimerasi II per la sintesi dell’RNA messaggero (mRNA) RNA polimerasi III per la sintesi dell’RNA transfer (tRNA)

PROCARIOTI ED EUCARIOTI Negli eucarioti è presente una compartimentalizzazione nucleo-citoplasma Prima di passare nel citoplasma, l’RNA deve essere modificato mediante una serie di eventi noti come processo di maturazione dell’RNA

Maturazione dell’mRNA Il capping è una delle tappe di maturazione del pre-mRNA a mRNA che consiste nell'aggiunta di un "cappuccio" di 7-metil guanosina al residuo 5-terminale della catena con un legame 5,5' trifosfato. E’ importante per stabilizzare l’mRNA e per mediare l’interazione con il ribosoma L’aggiunta di una sequenza poliadenilica di circa 200 nucleotidi (poli-A), all'estremità 3'-OH del pre-mRNA tramite legame covalente. Quasi tutti gli mRNA possiedono una coda poli-A. Un'eccezione è rappresentata dall'mRNA che codifica per le proteine istoniche. Le code di poli-A stabilizzano l’interazione ribosomi-mRNA durante la traduzione.

Gli introni e lo splicing del trascritto primario Phillip A. Sharp e Richard Roberts nel 1977 (Premio Nobel nel 1993) Differenze tra DNA genomico e mRNA corrispondente in geni di Adenovirus Dall'RNA vengono rimosse sequenze non codificanti chiamate “introni” mediante un processo detto “splicing”

Visualizzazione degli introni del gene dell’ovoalbumina di pollo al microscopio elettronico “The ovalbumin gene is split in chicken DNA”, Paul Chambon 1977-1981

Quali sono le modalita con cui questo avviene? L’informazione presente nei geni sotto forma di sequenza nucleotidica di DNA e poi “trasferita” nell’mRNA deve essere decodificata in modo da portare alla sintesi di una specifica proteina Quali sono le modalita con cui questo avviene? Esiste un “linguaggio”, ovvero un “codice” per interpretare l’informazione genetica?

La decifrazione del codice genetico

Relazione tra numero di nucleotidi e numero di aminoacidi noti Le basi azotate sono 4: A,T,C,G, mente gli aminoacidi presenti nelle proteine sono 20. Un codice di due nucleotidi produrrebbe solo 16 (42) “parole” diverse. Un codice a triplette porta alla formazione di 64 (43) “parole” Dato che gli aminoacidi sono 20, più di una tripletta dovrebbe specificare per una dato amminoacido (degenerazione del codice)

Il codice genetico L’analisi della sequenza di varie proteine mutate (catena beta dell’ emoglobina) aveva messo in luce che la sostituzione di un singolo nucleotide può portare alla sostituzione di un solo un amminoacido per volta in una catena polipeptidica Se il codice fosse letto a sovrapposizioni, la sostituzione di una base potrebbe causare la sostituzione anche di due o tre amminoacidi adiacenti nella sequenza della proteina, cosa che non era stata mai osservata.

Dimostrazione che il codice è letto a triplette

La natura del codice genetico (1961)

L’esperimento di Crick e Brenner (1961) Crick e Brenner sospettavano che la proflavina potesse causare inserzioni e delezioni di singoli nucleotidi (agente che si intercala nella doppia elica di DNA). Indussero mutanti nel locus rII del fago T4 trattando con proflavina Fenotipo delle placche fagiche Placca mutante più grande con margini netti Placca wild-type piccola torbida con margini sfumati

Mutazioni indotte da proflavina e loro reversione soppressore Il mutante rII, detto FC0, può revertire al fenotipo wild-type in seguito a una seconda mutazione nello stesso gene. Il revertante è quindi un doppio mutante La mutazione FC0 e il soppressore si possono separare mediante crossing over. La mutazione soppressore risultò essere anch’essa una mutazione rII

Crick e Brenner ipotizzarono che la mutazione FC0 fosse causata dall’inserzione di un nucleotide e quella soppressore da una delezione di un nucleotide La mutazione FC0 fu definita “+” e quella soppressore “-”

Crick e Brenner isolarono altre mutazioni appartenenti alle categorie “+” e “-” Analizzarono l’effetto fenotipico della combinazione di varie mutazioni Due mutazioni di segno opposto (una mutazione “-” e una mutazione “+”) ristabilivano il fenotipo selvatico Due mutazioni dello stesso segno (due “+” o due “-”) non davano mai fenotipo selvatico Tre mutazioni dello stesso segno (tre “+” o tre “-”) potevano ristabilivano il fenotipo selvatico

Effetto fenotipico della combinazione di varie mutazioni + - + - selvatico - + + + - - mutante + + + + + + - - - - - - selvatico

Esempio di delezioni e inserzioni di singole lettere in una frase fatta da parole di tre lettere

Altro esempio Sai che Ugo ama Lia Sai ceU goa maL ia delezione Sai ceU goa maL ia R delezione seguita da inserzione Sai ceU goa maL ia SaR ice Ugo ama Lia

RIFERENDOSI ALLA SEQUENZA NUCLEOTIFICA….

Tre inserzioni

sempre più sofisticate I risultati dell’esperimento di Crick e Brenner rappresentarono la prima evidenza sperimentale a favore di un codice letto a triplette (o a multipli di tre) Il codice genetico è stato in seguito completamente decifrato utilizzando varie metodiche di sintesi proteica in vitro sempre più sofisticate

Nirenberg e Matthaei 1961 Sintesi di mRNA poliU, poliA e poliC per traduzione in vitro

Esperimenti di Khorana e di Niremberg e Leder (1964) Khorana (1964) sintetizzò dei polimeri di due nucleotidi ripetuti come UGUGUGUGUG In sistemi di sintesi proteica in vitro UGUGUGUGUG induceva la formazione di polipeptidi costituiti da una sequenza alternata degli aminoacidi valina-cisteina UGU GUG UGU GUG UGU GUG Cys — Val — Cys — Val — Cys — Val Niremberg e Leder (1964): Sintesi di mini-mRNA fatti di tre nucleotidi che stimolavano il legame ai ribosomi dello specifico aminoacil-tRNA corrispondente

61 codoni di senso 3 codoni non senso (stop)

Caratteristiche generali del codice genetico E’ letto a triplette, senza sovrapposizioni Più codoni possono specificare lo stesso amminoacido (il codice è degenerato) Esiste un codone di inizio AUG che codifica per la metionina (se inserita all’inizio è formilata nei procarioti) Esistono tre codoni di stop: UAG UGA e UAA E’ continuo, senza pause E’ universale (con qualche rara eccezione)

Eccezioni all’universalità del codice genetico

Eccezioni all’universalità del codice genetico Sono stati scoperti altri aminoacidi Selenocisteina: Identificata nel 1986, codificata dal codone UGA, normalmente un codone di stop. Pirrolisina: prima volta nel 2004 in un archaebatterio, il Methanosarcina barkeri. Esso è il 22° amminoacido conosciuto, è un derivato della lisina. Come la selenocisteina, è codificato da un codone di stop, UAG.

Dal codice genetico alla sintesi delle proteine

I principali elementi cellulari coinvolti nella sintesi proteica sono: Ribosomi mRNA tRNA

I ribosomi

sito di riconoscimento del codone L’RNA transfer L’RNA transfer trasporta gli amminoacidi ai ribosomi per sintetizzare le proteine sito di legame dell’amminoacido sito di riconoscimento del codone

Esiste una cinquantina di tRNA, di conseguenza in alcuni casi lo stesso tRNA deve poter “leggere” più di un codone che codifica per un dato amminoacido Questo è possibile per il vacillamento o oscillazione della terza base dell’anticodone Degenerazione del codice

Inizio della traduzione Il ribosoma interagisce con la molecola di mRNA in corrispondenza del codone (tripletta) di inizio AUG. Nel sito P, il codone AUG si appaia all’anticodone del tRNA che porta la metionina (N-formil metionina nei procarioti). Nel sito A entra il tRNA corrispondente al secondo codone (Ser-tRNA)

Formazione del legame peptidico Una volta entrato (Ser-tRNA) nel sito A, si forma il legame peptidico tra la metionina iniziale e il secondo amminoacido grazie alla peptidil-transferasi

La traduzione procede Il ribosoma si sposta sull’mRNA in direzione 3’ e il peptidil-tRNA trasloca nel sito P permettendo che il codone successivo sia disponibile nel sito A all’attacco con l’anti-codone del tRNA specifico. Mano a mano che il ribosoma si sposta si ha l’allungamento della catena polipeptidica

Fine della traduzione Il ribosoma raggiunge le triplette di stop (UAG,UAA,UGA) per le quali non esiste un corrispondente tRNA Uno specifico fattore di rilascio induce il distacco del polipeptide sintetizzato e il successivo disassemblaggio del ribosoma