Il cancro (dal greco kàrkinos = granchio)  insieme eterogeneo di malattie Le cellule cancerose sono caratterizzate da: perdita di controllo della crescita (proliferazione eccessiva) e acquisizione della capacità di invadere altri organi o tessuti, talvolta distanti dalla massa tumorale da cui sono derivate (metastasi)

Cellule tumorali  cellule che hanno perso il controllo della crescita ed hanno acquisito la capacità di moltiplicarsi senza limiti Tumore benigno  non ha la capacità di invadere altri tessuti e di dare metastasi Tumore maligno o cancro  ha proprietà invasive (e metastatizzanti). Le cellule cancerose conservano parte delle caratteristiche funzionali del tessuto da cui derivano

Le cellule di tumori maligni hanno acquisito alcune caratteristiche fondamentali: Indipendenza da segnali di crescita esterni Insensibilità a segnali antiproliferativi esterni Capacità di evitare l’apoptosi Capacità di replicazione indefinita Capacità di stimolare angiogenesi e vascolarizzazione Capacità di invadere altri tessuti

Figure 3.7a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Il cancro è una malattia genetica  la proliferazione cellulare è sotto controllo genetico  mutazioni (somatiche) di geni che controllano questo complesso processo possono trasformare una cellula normale in una cellula tumorale Solo una piccola frazione dei casi di cancro è rappresentata da malattie genetiche in senso classico

I possibili destini evolutivi di una cellula

Il destino evolutivo di una cellula è sotto il controllo di numerosi fattori che possiamo MOLTO schematicamente suddividere in STIMOLATORI e INIBITORI Segnali stimolatori Segnali inibitori Bilanciamento tra proliferazione e maturazione Aumento non regolato dei segnali stimolatori  proliferazione incontrollata Perdita dei segnali inibitori  proliferazione incontrollata

Il cancro può essere considerato una malattia dell’invecchiamento: la probabilità di contrarre il cancro aumenta in maniera esponenziale con l’aumentare dell’età

Incidenza dei tumori in Italia nel periodo 2008-2012 per sesso e per classi di età

Motivi: Accumulo di mutazioni Minore efficienza dei sistemi di controllo Il cancro è fondamentalmente una malattia dell’età post-riproduttiva per cui la pressione selettiva contro di esso è molto bassa

una sola MUTAZIONE non può convertire una cellula somatica normale in una cellula maligna Nella maggior parte dei casi per convertire una cellula normale in un carcinoma invasivo sono necessarie 6-7 MUTAZIONI INDIPENDENTI La probabilità teorica che ciò si verifichi è quindi estremamente bassa: 1013 numero di cellule; 10-5-10-6 rate di mutazione per gene per cellula

Quali meccanismi rendono, non solo possibile, ma anche relativamente frequente il verificarsi di un evento che in teoria è estremamente improbabile?

Alcune mutazioni promuovono la proliferazione cellulare e forniscono in tal modo un vantaggio selettivo alla cellula in cui si è verificata  nasce una popolazione di cellule tutte portatrici della prima mutazione

Alcune mutazioni interessano geni coinvolti nel mantenimento della stabilità dell’intero genoma, sia a livello di DNA che di cromosomi. In tal modo, aumenta il tasso di mutazione complessivo (quindi anche quello dei geni più direttamente responsabili del fenotipo tumorale)

1919  scoperta del primo virus oncogeno anni ‘60  individuazione del gene virale (v-onc) responsabile dell’induzione del tumore (in virus a RNA) 1976  dimostrazione che nel genoma di cellule normali (anche in quello di cellule che non sono mai state a contatto con il virus) sono presenti geni omologhi ai v-onc Questi geni sono stati chiamati c-onc (= oncogeni cellulari) o proto-oncogeni, mostrano un’elevata conservazione evolutiva e sono espressi da cellule normali  svolgono funzioni essenziali

I proto-oncogeni quali funzioni svolgono normalmente? Classe eterogenea di geni che codificano per segnali STIMOLATORI del ciclo cellulare, comprendono: Fattori di crescita cellulare Recettori di membrana per fattori di crescita Proteine coinvolte nella trasduzione del segnale Fattori di trascrizione in grado di legarsi al DNA Cicline, chinasi ciclino-dipendenti e loro inibitori e attivatori (= regolatori del ciclo cellulare) Geni con funzioni anti-apoptopiche

FUNZIONI DEI PROTO-ONCOGENI CELLULARI

Meccanismo di attivazione dei recettori per fattori di crescita

Le proteine RAS

Guanine nucleotide Exchange Factors GTPase Activating Proteins Modificata da The Biology of Cancer, Garland Science, 2006

Quali tipi di mutazioni trasformano un proto-oncogene in oncogene? Le mutazioni oncogèniche sono mutazioni del tipo ‘acquisizione di funzione’ di varia natura e generalmente sono dominanti: Mutazioni puntiformi che cambiano le proprietà della proteina codificata Amplificazione genica (anche centinaia di copie) Traslocazioni di segmenti cromosomici che portano il proto-oncogene in regioni trascrizionalmente attive Traslocazioni cromosomiche che creano geni chimerici

Mutazioni che trasformano un proto-oncogene in oncogene (mutazioni oncogèniche)

Amplificazione dell’oncogene MYCN

Singola Sostituzione Nucleotidica MisSense Mutazioni che trasformano un proto-oncogene in oncogene: mutazioni puntiformi esoniche o delezioni di sequenze codificanti Singola Sostituzione Nucleotidica MisSense Delezione parziale Formazione di dimeri in assenza di ligando per mutazione del recettore. Figure 5.12a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Gli aa. delle proteine RAS più frequentemente mutati nei tumori si trovano nel sito di legame per il GTP/GDP Le proteine RAS sono mutate in ca. 1 tumore 6

Traslocazione 9-22(q34;q11)  formazione del cromosoma Philadelphia (leucemia mieloide cronica): creazione di un gene chimerico

Il cromosoma Philadelphia è un piccolo cromosoma acrocentrico presente nel 90% dei pazienti affetti da leucemia mieloide cronica Il gene di fusione BCR/ABL produce una proteina simile a quella prodotta da ABL, ma costitutivamente attiva

Traslocazione di un oncogene in un dominio trascrizionalmente molto attivo 8-14(q24;q32), presente nell’80-85% dei pazienti affetti da linfoma di Burkitt Il restante 15-20% dei pazienti presenta altre due traslocazioni: 2-8(q11;q24) oppure 8-22(q24;q11) Nella regione 8q24 si trova l’oncogene MYC, sui cromosomi 14, 2 e 22 si trovano i geni per le catene H e L delle immunoglobuline  geni espressi a livelli molto elevati nei linfociti B La traslocazione di MYC in una regione trascrizionalmente molto attiva provoca la sua iper-espressione

Un’altra importante categoria di geni coinvolti nella trasformazione tumorale è quella dei geni soppressori di tumore (geni TS = Tumor Suppressor) La loro esistenza è stata ipotizzata sulla base di: Esperimenti di fusione in vitro tra cellule normali e cellule tumorali  talvolta si ha la correzione del fenotipo trasformato e restaurazione di un fenotipo normale; Esistenza di tumori caratterizzati da piccole specifiche delezioni in omozigosi; Studi sulle rare forme di tumori ereditari

1971 studi di Knudson sul Retinoblastoma Raro tumore infantile dei retinoblasti (ca. 1/20 000 nati) 60% forme sporadiche, unilaterali e monofocali età di insorgenza media: 29 mesi 40% forme ereditarie, trasmissione AD a penetranza incompleta ma comunque molto elevata, bilaterali e multifocali, età di insorgenza media: 15 mesi

IPOTESI DEI DUE COLPI Il tumore insorge quando entrambe le copie del gene Rb sono non funzionanti Nei casi sporadici devono verificarsi 2 eventi mutazionali nello ‘stesso’ retinoblasto Nei casi ereditari TUTTE le cellule sono portatrici di una mutazione a carico di Rb, è quindi sufficiente 1 solo evento mutazionale (a carico del secondo allele)

Retinoblastoma bilaterale Rischio più elevato di avere altri tipi tumori Insorgenza precoce Retinoblastoma unilaterale Non aumenta il rischio di avere altri tumori Insorgenza più tardiva no. retinoblasti 106-107, tasso mutazione per gene per cellula ca. 10-5

Meccanismi mutazionali responsabili del ‘secondo colpo’ (studi su casi di tumore ereditari) Il secondo colpo può essere anche rappresentato da ipermetilazione del promotore o di altre regioni di controllo dell’espressione genica

Distribuzione e tipo di mutazione (MS o PTC) in due oncogeni e in due geni TS

Il gene RB1 è localizzato sul cromosoma 13 in una piccola percentuale dei casi ereditari, la mutazione ereditata è una delezione o una traslocazione di questa porzione di cromosoma Il gene RB1 è espresso in molti altri tessuti oltre alla retina, ma la perdita di RB1 è in grado di “iniziare” tumori precoci solo nella retina e, più tardi nella vita, in pochi altri siti secondari (sarcomi, fibrosarcomi e melanomi) Il prodotto del gene RB1 è la proteina p110 Rb1 (110 kDa): è una fosfoproteina che viene ipo- (forma attiva) o iper-fosforilata nei diversi stadi del ciclo cellulare e ha un’importanza cruciale nel punto di controllo G1-S

Qual è normalmente la loro funzione? Lo studio di altri tipi di tumori ereditari e di regioni che mostrano LoH (Loss of Heterozigosity) in cellule tumorali ha portato all’identificazione di numerosi geni TS Qual è normalmente la loro funzione?

Classe molto eterogenea, producono fattori INIBITORI del ciclo cellulari o fattori pro-apoptotici o fattori coinvolti nel mantenimento della stabilità del genoma geni direttamente coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare; es. RB1 (p110); TP53 (p53) geni coinvolti nella inibizione della crescita da contatto cellula-cellula; es. NF2 (Nf2) geni coinvolti nella riparazione dei danni al DNA e nel mantenimento della integrità genomica; es. BRCA1 e BRCA2 (Brca1 e Brca2); MLH1 e MLH2 (Mlh1 e Mlh2)

Il ciclo cellulare e i suoi punti di controllo principali

I principali geni TS: RB1  produce la proteina pRB, è espresso in tutti i tessuti. La forma attiva è defosforilata e blocca la trascrizione di E2F1 gene necessario per il passaggio G1-S. La sua inattivazione (tramite fosforilazione) è finemente regolata da una complessa rete di cicline e di chinasi ciclina-dipendenti e consente alla cellula di entrare in fase S Mutazioni di RB1 sono coinvolte principalmente in tumori delle ossa e nel retinoblastoma

TP53  produce la proteina p53 che svolge numerose funzioni TP53  produce la proteina p53 che svolge numerose funzioni. E’ stato definito ‘guardiano del genoma’, è fortemente coinvolta nel checkpoint G1-S  blocca le cellule con un DNA danneggiato consentendo la riparazione del danno o inducendo la cellula ad andare in apoptosi Le mutazioni di TP53 costituiscono probabilmente il più frequente singolo cambiamento genetico coinvolto nella trasformazione tumorale Mutazioni germinali di TP53 sono responsabili della Sindrome di Li-Fraumeni (trasmissione AD, tumori multipli)

CDKN2A  codifica per 2 proteine strutturalmente non correlate p16 (o INK4A)  agisce a monte di RB1 inattivando le chinasi che fosforilano pRB (forma inattiva). La sua assenza causa quindi, indirettamente, un aumento della fosforilazione di pRB, cioè della sua forma inattiva p14 (o ARF)  blocca il gene MDM2 che, a sua volta, blocca p53 (la lega e la degrada); quindi l’assenza di p14 causa, in maniera indiretta , la diminuzione di p53

p16 (o INK4A)  agisce a monte di RB1 inattivando le chinasi che fosforilano pRB (forma inattiva). La sua assenza causa quindi, indirettamente, un aumento della fosforilazione di pRB, cioè della sua forma inattiva p14 (o ARF)  blocca il gene MDM2 che, a sua volta, blocca p53 (la lega e la degrada); quindi l’assenza di p14 causa, in maniera indiretta , la diminuzione di p53 MDM2 inattiva RB (e quindi favorisce la progressione nel ciclo cellulare); P16 e e p14 bloccano MDM2, quindi, indirettamente, favoriscono l’aumento di RB MDM2 è una proteina che aggiunge ubiquitina ad altre proteine (come RB e p53) marcandole per la loro degradazione

In alcuni casi riduzione modeste nell’espressione di geni TS possono avere effetti, gli esiti sono anche fortemente dipendenti dalla concomitante presenza di mutazioni in altri geni chiave

TP53, in alcuni casi si comporta da oncogene. Alcune mutazioni MS causano contemporaneamente due effetti (e si comportano da dominanti-negativi): (1) la produzione di una proteina mutata che induce l’espressione di geni (non indotti da p53 wild-type) che stimolano la proliferazione cellulare o che inibiscono l’apoptosi elevati livelli di tale forma mutata di p53 (dovuta alla a incapacità di stimolare la produzione del suo inibitore MDM2) p53 è un omotetramero, in eterozigoti +/mut-MS la proteina mutata sequestra molecole di p53 wt

Proliferazione e differenziamento cellulare sono sotto stretto controllo genetico, i geni coinvolti sono numerosi così come le vie di controllo che sono oltre tutto interconnesse e parzialmente ridondanti. Alcuni geni (e alcune vie) sono espressi in modo specifico in uno o pochi tipi cellulari, mentre altri hanno un’espressione sostanzialmente ubiquitaria L’interruzione di una determinata via potrebbe avere effetti diversi in tipi cellulari diversi e indurre l’attivazione di una via alternativa solo in un determinato tessuto

Il destino evolutivo di una cellula è determinato da una complessa rete di interazioni parzialmente ridondanti E’ estremamente difficile prevedere le conseguenze che specifiche mutazioni possono avere in specifici tessuti