SCHIZOMICETI BATTERI Procarioti DNA ed RNA Microrganismi unicellulari, più piccoli ( ca 1µ) e meno complessi, capaci di autoreplicazione Thiomargarita nabimiensis 10-300 µm Procarioti DNA ed RNA Parete batterica eccetto micoplasmi e batteri che vivono in habitat ad alta conc salina Replicazione per scissione binaria Molto abbondanti in natura cicli biologici Per lo più autonomi Simbiosi con altre forme di vita parassiti facoltativi, parassiti obbligati patogeni (virulenza e patogenicità)

Metodi di studio in microbiologia Tradizionali visualizzazione  microscopia Gram, Ziehl-Neelsen forma, dimensioni, disposizione, caratteristiche tintoriali IF forma, dimensioni, disposizione, sede intracellulare, identificazione coltivazione terreni artificiali in vitro agarizzati  colonie  coltura pura brodi  sospensione cellulare in vivo (animali, da esperimento, colture cellulari) analisi antigene Innovativi metodiche biomolecolari analisi proteine, lipidi, acidi nucleici

Batteri colorazione di Gram Gram pos blu-violetto Gram neg rossi

Batteri Eccetto se parassiti obbligati, si possono coltivare su terreni artificiali, solidi o liquidi esigenze nutrizionali temperatura ottimale tensione O2 aerobiosi, microaerofilia, anaerobiosi

Meccanismi molteplici Catalasi Superossido-dismutasi Anaerobi Batteri incapaci di svolgere in presenza di ossigeno i processi catabolici necessari alla produzione di energia, ATP, da utilizzare nelle reazioni anaboliche, biosintetiche Meccanismi molteplici Catalasi scindono perossidi formati in presenza di ossigeno Superossido-dismutasi protezione dall’azione nociva del radicale superossido libero Stretti -O2  0.5%- e meno stretti -O2  2-8%- Gram pos Clostridium Gram neg Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Treponema, …

Schema di cellula procariota

Batteri Il citoplasma batterico spicca per l’alta concentrazione salina Salvo eccezioni, i batteri si trovano in ambiente ipo-osmotico  richiamo di acqua  lisi osmotica I batteri devono resistere alla lisi osmotica

Batteri Membrana citoplasmatica Simile per struttura e funzioni alla membrana delle cellule eucariotiche barriera di permeabilità trasporto di soluti Assenza di steroli Maggior contenuto proteico proteine non glicosilate Sede di funzioni appannaggio, nella cellula eucariotica, di organuli intracitoplasmatici sistema trasporto elettroni

Strutture ACCESSORIE Capsula [strato mucoso] Appendici filiformi protezione Appendici filiformi Pili, Fimbrie adesività Ciglia, flagelli, filamenti assiali [o endoflagelli] movimento Granuli

Capsule e strati mucosi Esterni alla parete ben strutturati: capsula non ben strutturati: strato mucoso, glycocalix Polimerici, per lo più polisaccaridici talvolta poliaminoacidici (non proteine) Tendenza a essere persi nei passaggi in coltura Importanti se fattori di virulenza Antigeni  anticorpi protettivi

Pili (fimbrie) Adesine Proiezioni filiformi dalla superficie Pili sessuali coniugazione  ricombinazione genetica Adesine importanti se fattori di virulenza antigeni  anticorpi protettivi

Parete batterica Anti lisi osmotica Involucro rigido al di sopra della membrana citoplasmatica Anti lisi osmotica Forma Bastoncini, cocchi, a virgola, a spirale Caratteristiche tintoriali Gram, alcool-acido resistenza Virulenza e patogenicità Sede di antigeni

Peptidoglicano o Mureina componente strutturale della parete singola macromolecola lunghissimo polimero lineare, stabilizzato da fitti legami trasversi avvolge la cellula, formando un astuccio rigido e resistente determina la forma impedisce il rigonfiamento

Peptidoglicano o Mureina Il monomero Due aminozuccheri (NAM e NAG) legati da legame glucosidico Polipeptide (4 o5 aa) legato al NAM

Peptidoglicano o Mureina

Peptidoglicano Sintesi

Peptidoglicano Sintesi

Peptidoglicano Sintesi

Parete batterica La parete batterica nella sua componente del peptidoglicano costituisce il bersaglio di molti antibiotici Tali antibiotici agiscono impedendo la sintesi del peptidoglicano Antibiotici diversi agiscono su momenti diversi del processo sintetico assemblaggio finale  transpeptidizzazione passaggio trans-membrana sintesi del monomero

Parete Gram neg e Gram pos

VIRULENZA probabilità che si instauri il rapporto infettivo PATOGENICITA’ probabilità che si instauri la malattia

Virulenza caratteristica propria e qualificante degli agenti di infezione in quanto tali Capacità di superare le difese dell’ospite Probabilità che si instauri il rapporto infettivo Variabile estrinseca o relativa dipende dall’ospite che si considera Variabile quantitativa misurabile Dose Infettante 50 Generalmente multifattoriale fattori di virulenza cellulari o solubili antigeni  risposta protettiva Correlata alla patogenicità

Fattori di virulenza Immunità Adesine (pili o fimbrie, capsule) innata acquisita Adesine (pili o fimbrie, capsule) Fattori antifagocitari uccisione del fagocita (leucocidine) evasione (capsula) resistenza al killing intrafagocitario Invasine Proteine chelanti il Fe (IBP), siderofori Fattori istotossici (proteasi) …… sIgA proteasi Mimetismo e variabilità antigene

Patogenicità Capacità di provocare il danno Probabilità che si instauri la malattia Variabile estrinseca o relativa dipende dall’ospite che si considera Variabile quantitativa misurabile Dose 50 Generalmente multifattoriale fattori di patogenicità cellulari o solubili antigeni  risposta protettiva Non strettamente correlata alla virulenza

Patogenesi Replicazione intensa Tossicità risposta flogistica Terapia mediatori della flogosi alterazioni funzionali sintesi proteica rilascio neurotrasmettitori equilibrio idrico Terapia  Prevenzione

Patogenicità microbica prevalentemente, ma non esclusivamente, infettiva Patogenicità svincolata dalla virulenza alcuni agenti producono delle tossine così potenti che il danno e la patologia possono essere forti e gravi anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo o di reazione infiammatoria tetano; botulismo classico; colera patologia anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo

Fattori di patogenicità classicamente rappresentati dalle tossine esotossine rilasciate da Gram pos e Gram neg proteiche buoni immunogeni specie-specifiche tossine binarie, citolisine, superantigeni alcune molto potenti endotossina componente membrana esterna Gram neg LPS non buon immunogeno non specie-specifico tossicità indiretta  rilascio di mediatori cellulari non molto potente Vaccini Sieri

Esotossine c-AMP alterazione contenuto intracellulare tossina colerica diarrea tossina pertussica Sintesi proteica inibizione tossina difterica Citoscheletro alterazioni funzioni tossina C.difficile Rilascio di neurotrasmettitori interferenza tossina tetanica  paralisi spastica tossina botulinica  paralisi flaccida Superficie cellulare Citolisine Linfociti T attivazione policlonale superantigeni stafilococcici

LPS endotossina

Patogenicità microbica prevalentemente, ma non esclusivamente, infettiva Patogenicità svincolata dalla virulenza alcuni agenti producono delle tossine così potenti che il danno e la patologia possono essere forti e gravi anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo o di reazione infiammatoria tetano; botulismo classico; colera patologia anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo

Disinfectant Selection Table

La spora batterica Citoplasma povero di H2O Dipicolinato di Calcio Rivestimenti costituiti da proteine ricche in legami disulfidrici

La spora batterica Forma di resistenza Caratteristica di alcuni generi temperature estreme agenti chimico-fisici di disinfezione mancanza di acqua Metabolicamente inattiva Differenziazione della cellula batterica Caratteristica di alcuni generi Bacillus, Clostridium Non legata alla replicazione batterica cellula vegetativa  spora  cellula vegetativa La spora infetta non in quanto tale deve ritornare a cellula vegetativa

Cinetica di sviluppo di una popolazione batterica Conta batterica Cellule totali camera contaglobuli stime correlate col numero di cellule concentrazione proteica turbidimetria proprietà ottiche delle sospensioni e loro dipendenza dal numero di particelle Cellule vive subcoltivazione in agar  conta colonie una colonia  una cellula Concentrazione batterica rispetto al tempo Trapianto in terreni liquido A tempi diversi aliquota fissa Conta

Fasi della crescita batterica Latenza numero costante attività di sintesienzimi per utilizzazione terreno enzimi costitutivi/adattativi Crescita logaritmica aumento esponenziale attività sintetica al max Stasi numero costante o in diminuizione esaurimento fattore limitante lo sviluppo conte totali vs conte vitali Differenze fisiologiche in rapporto alla fase di sviluppo sensibilità agli antibiotici, ai fagi; …. infezione acuta vs infezione cronica

Denominazione linneiana Genere e specie Specie batterica: insieme di ceppi con alcune caratteristiche a comune che li differenziano da altri ceppi Tipo  Specie  Genere  Famiglia  Ordine  Classe  Philum  Regno Denominazione linneiana Genere e specie Escherichia coli Treponema pallidum, Treponema denticola Clostridium tetani, Clostridium botulinum Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis Helicobacter pylori Differenze al di sotto della specie  tipi E.coli O157H7 Str. pyogenes M12 Str. mutans c

I farmaci antibatterici Prodotti naturali di miceti o batteri, antibiotici (competizione vitale) o composti sintetici, chemioterapici che uccidono [battericidi] o inibiscono [batteriostatici] la crescita dei batteri MBC Concentrazione Minima Battericida MIC Concentrazione Minima Inibente

I farmaci antibatterici bersaglio e meccanismi azione Acidi nucleici sintesi precursori acidi folici sulfamidici, trimethroprim sintesi DNA novobiocina, chinolonici, metronidazolo sintesi RNA rifampicina Parete sintesi peptiglicano sintesi dei precursori cicloserina passaggio trans-membrana bacitracina ristocetina assemblaggio –lattamici, vancomicina sintesi composti tipici dei micobatteri acidi micolici isoniazide arabinogalattano etanbutolo Sintesi proteica subunità 30S aminoglicosidi, tetracicline subunità 50S macrolidi, cloramfenicolo fattori extraribosomiali acido fusidico Membrana membrana esterna Gram neg disorganizzazione polimixine

I farmaci antibatterici farmaco-resistenza Resistenza innata o intrinseca caratteristica di un gruppo, specie, genere nota a priori Meccanismi assenza del bersaglio lattamici, altri  micoplasmi ostacolo alla entrata nella cellula batterica aminoglicosidi  O2-dipendente  anaerobi vancomicina  gram-neg non attivazione nella cellula batterica metronidazolo  aerobi Resistenza estrinseca o acquisita cambiamento del genoma evoluzione pochi ceppi di un gruppo, specie, genere  selezione non nota a priori sotto i nostri occhi Meccanismi sul batterio modificazione del bersaglio impedimento al raggiungimento del bersaglio aumento dell’efflusso sul farmaco modificazione enzimatica distruzione enzimatica

I farmaci antibatterici Antibiogramma saggio in vitro per guidare la terapia antibatterica il ceppo isolato viene saggiato contro un pannello di antibiotici verranno non impiegati quello/quei farmaci verso i quali si ha resistenza per gli altri si sceglierà quello più adatto sede di infezione e farmacocinetica condizioni del soggetto costo tossicità

Antibiogramma - M. diffusione in piastra Sensibile Multiresistente

Adattabilità ad un nuovo ambiente ambiente inanimato  ambiente animato sedi diverse nell’ospite espressione coordinata dei fattori di virulenza e patogenicità controllata da fattori ambientali temperatura, fonti carbonio, osmolatrità, conc Fe, nutrienti … Regolazione Sequenza DNA amplificazione del gene riarrangiamento del gene Trascrizione attivatori repressori Post-trascrizione modificazione covalente clivaggio proteolitico legame a proteine della cellula ospite

Genoma batterico informazione replicazione sincrona con divisione cellulare Cromosoma unico e Unità genetiche accessorie (plasmidi) assenza di istoni unità trascrizionali multicistroniche quasi tutta la sequenza per codificazione proteine regolazione trascrizione Aploidia espressione fenotipica immediata di un qualsiasi cambiamento controllo attivazione/disattivazione promoters

Batteri Plasmidi DNA extracromosomico copie multiple informazione per fattori di virulenza & patogenicità antibiotico-resistenza…. trasferibili coniugazione batterica

Adattabilità variazioni fenotipiche variazioni genotipiche tutta la popolazione si adatta fisiologicamente al nuovo ambiente nell’ambito del potenziale genomico cambia il fenotipo non il genotipo   espressione del gene/i variazioni genotipiche la cellula mutata viene selezionata perché meglio si adatta all’ambiente mutazione ricombinazione trasformazione, coniugazione, transduzione elementi genetici di trasposizione