13/11/11 1 1

Il nuovo Invito alla biologia.blu 13/11/11 H. Curtis, N. S. Barnes, A. Schnek, A. Massarini Il nuovo Invito alla biologia.blu 2 2 2

Il DNA ricombinante Capitolo E8 3 13/11/11 3 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 3 3

Gli strumenti dell’ingegneria genetica 13/11/11 Lezione 1 Gli strumenti dell’ingegneria genetica 4 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 4 4

La tecnologia del DNA ricombinante 13/11/11 La tecnologia del DNA ricombinante La tecnologia del DNA ricombinante è alla base dell’ingegneria genetica. È stata resa possibile dalla scoperta di enzimi che ci permettono di tagliare il DNA in frammenti (enzimi di restrizione ) e successivamente di incollarli (ligasi), includendo al loro interno porzioni di DNA di varia provenienza. 5 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 5 5

13/11/11 Estrazione del DNA Per analizzare il DNA è necessario estrarlo da un campione. 6 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 6 6

Gli enzimi di restrizione 13/11/11 Gli enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione o endonucleasi sono in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di specifiche sequenze di nucleotidi, dette siti di restrizione. L’enzima EcoRI è uno degli enzimi più usati in laboratorio: La presenza di estremità sfalsate o coesive è fondamentale per ottenere DNA ricombinante. 7 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 7 7

L’elettroforesi su gel 13/11/11 L’elettroforesi su gel Per separare i frammenti di DNA ottenuti dopo il taglio con gli enzimi di restrizione si utilizza l’elettroforesi su gel. 8 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 8 8

13/11/11 Le ligasi Le ligasi sono gli enzimi che legano tra loro i frammenti di Okazaki che si ottengono sul filamento lento durante la replicazione del DNA. Sono utilizzati in laboratorio per saldare i frammenti di restrizione. 9 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 9 9

Clonare il DNA Lezione 2 10 13/11/11 10 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 10 10

13/11/11 Il clonaggio genico Il clonaggio genico è una tecnica che permette di trasferire un gene che codifica una proteina animale o vegetale dal suo ospite naturale a un batterio. Esistono due modi per effettuare un clonaggio: integrare il gene in un plasmide che poi sarà inserito, per trasformazione, nel batterio; integrare il gene nel cromosoma cellulare. 11 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 11 11

Il vettore di clonaggio 13/11/11 Il vettore di clonaggio Un vettore di clonaggio è un plasmide con tre caratteristiche importanti: un’origine di replicazione che assicuri che il vettore venga replicato all’interno della cellula; geni marcatori; uno o più siti unici di restrizione, dove possa essere inserito il frammento di DNA da clonare. 12 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 12 12

13/11/11 I marcatori La resistenza agli antibiotici può essere utilizzata come marcatore per distinguere quali batteri contengono il plasmide ricombinante. Aggiungendo al terreno di coltura un antibiotico, noteremo che solo i batteri che hanno acquisito il plasmide sopravvivono. 13 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 13 13

I vettori di espressione 13/11/11 I vettori di espressione Oltre che permetterci di ottenere molteplici copie del plasmide ricombinante, il clonaggio consente anche di produrre molecole di nostro interesse. Nel vettore bisogna inserire, insieme al gene, anche un promotore e un terminatore: vettori di espressione. 14 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 14 14

13/11/11 I vettori cromosomici Per ospitare frammenti di DNA più grandi sono stati utilizzati come vettori anche i fagi, i cromosomi artificiali batterici e di lievito e nuovi vettori chiamati cosmidi. 15 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 15 15

13/11/11 Le librerie genomiche Una libreria genomica o genoteca è una collezione di frammenti di DNA, ciascuno clonato in un vettore di clonaggio. 16 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 16 16

Screening della libreria 13/11/11 Screening della libreria L’identificazione di un gene all’interno di una libreria avviene tramite l’uso di sonde. 17 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 17 17

13/11/11 La libreria a cDNA Una libreria genomica può essere realizzata anche partendo da frammenti di DNA derivanti dai geni trascritti: sono chiamati DNA complementari o cDNA. 18 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 18 18

Replicare il DNA in provetta Lezione 3 19 13/11/11 19 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 19 19

13/11/11 La PCR /1 La PCR o reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction) è un metodo che consente di replicare il DNA in provetta per mezzo di una polimerasi, ottenendo numerose copie di una specifica sequenza. Per mettere in atto la PCR sono necessari: un DNA stampo, da cui copiare un nuovo filamento di DNA; due primer (inneschi) con un gruppo –OH libero all’estremità 3’ della catena, a cui aggiungere nuovi nucleotidi. 20 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 20 20

13/11/11 La PCR /2 21 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 21 21

13/11/11 Il DNA fingerprinting La PCR è oggi applicata soprattutto nelle analisi di DNA fingerprinting, ovvero alla definizione di impronte molecolari da utilizzare per indagini forensi. Queste analisi sono generalmente condotte analizzando i microsatelliti o brevi sequenze ripetute in tandem (STR). 22 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 22 22

Sequenziare il DNA: dai geni ai genomi Lezione 4 23 13/11/11 23 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 23 23

Il sequenziamento del DNA /1 13/11/11 Il sequenziamento del DNA /1 Sequenziare un frammento di DNA significa determinare l’ordine esatto nel quale si trovano i nucleotidi che lo costituiscono. Verso la metà degli anni Settanta, Frederick Sanger sviluppò un metodo di sequenziamento basato sull’allungamento del DNA da parte della DNA polimerasi, che prevedeva l’interruzione della sintesi ad opera di didesossinucleotidi. (metodo Sanger). 24 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 24 24

Il sequenziamento del DNA /2 13/11/11 Il sequenziamento del DNA /2 25 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 25 25

Il sequenziamento shotgun 13/11/11 Il sequenziamento shotgun Il sequenziamento shotgun permette di assemblare le porzioni di DNA sequenziate, in modo da determinare la sequenza di un intero genoma. 26 Curtis et al., Il nuovo Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2017 26 26