RICOMBINAZIONE GENETICA La ricombinazione genetica è un processo biologico che avviene normalmente in tutti gli organismi in seguito al quale si ha uno scambio del genoma (patrimonio genetico di cui è dotato un organismo) e si verifica normalmente con la rottura e la riunione del DNA. Oggi è possibile creare delle molecole ricombinanti tra segmenti di DNA che non presentano omologia e che possono provenire da organismi diversi. Con l'utilizzo coordinato dei vettori molecolari e degli enzimi di restrizione è possibile isolare una sequenza di DNA da qualsiasi organismo ed inserirla nel DNA di un altro. Le forme viventi che hanno subito tale trasformazione e che contengo un DNA estraneo vengono dette transgeniche. E' forse il caso di aprire una parentesi per chiarire il fatto che la clonazione della pecora Dolly non è stata ottenuta con tecniche di ingegneria genetica. http://www.molecularlab.it/index.asp

…..INIZIA LA STORIA Spesso le scoperte avvengono per caso: 1970: Hamilton Smith e Kent Wilcox ( ricercatori alla Johns Hopkins University) stavano lavorando con un batterio, l’Haemophilus influentiae, quando si accorsero che esso era in grado di inattivare i virus che lo infettavano tagliando in piccoli pezzi il loro il DNA, ma riuscendo a difendere il proprio DNA. il DNA del virus veniva immancabilmente ridotto in frammenti inattivi, cioè la crescita del virus si disse ristretta in un determinato ceppo di batteri. Di qui il nome di enzimi "di restrizione". Gli enzimi di restrizione sono ritenuti essere una sorta di sistema immunitario primitivo dei batteri. Non passò molto tempo e il primo di questi enzimi venne purificato e battezzato HindII: esso riconosce le due sequenze: •GTGCAC •GTTAAC Come fu successivamente scoperto essi attaccano solamente il DNA esterno, ad esempio di un virus, perché il DNA dei batteri presenta delle modificazioni chimiche, per la precisione l’aggiunta del gruppo metile (CH3) , sui residui di A e C, che lo rendono inattaccabile dai propri enzimi.

ENZIMA DI RESTRIZIONE Enzima capace di riconoscere un sito particolare del DNA (sequeza palindrome), di fissarvisi e di realizzare un taglio dei due filamenti del DNA. Le estremità del taglio possono riappaiarsi. La caratteristica che rende così preziosi gli enzimi per lo studio del DNA è che ognuno di essi riconosce, lega e taglia il DNA in una sequenza ben precisa. Ad esempio, EcoRI (isolato da Escherichia coli RY13) riconosce la sequenza GAATTC, mentre BamHI (isolato da Bacillus amyloliquefaciens H) la sequenza GGATCC.

COME FUNZIONA L’ENZIMA DI RESTRIZIONE L’enzima di restrizione scinde il DNA in modo da lasciare alle due estremità due sequenze coesive o “sticky ends”, che possono, in opportune condizioni, ricongiungersi mediante legami a idrogeno, appaiando le basi azotate poste sui segmenti complementari di DNA a filamento singolo. Il collegamento fra due porzioni di DNA di diversa provenienza, ma tagliati con lo stesso enzima di restrizione (ciò da origine a estremità complementari che possono poi unirsi) è possibile grazie al fatto che le due estremità coesive una volta appaiate, possono essere stabilmente saldate tra loro grazie a un altro enzima detto DNA-ligasi. Tagliando con il medesimo enzima di restrizione un segmento di cromosoma in un organismo qualunque e il DNA di un altro organismo e mescolando il tutto, è possibile che le relative estremità coesive si incontrino e si leghino dando origine ad una nuova sequenza ibrida di DNA detta DNA ricombinante.

Oggi si conoscono centinaia di enzimi di restrizione Oggi si conoscono centinaia di enzimi di restrizione. Essi vengono usati sia nell’industria che nella ricerca

ELETTROFORESI Una volta che il DNA è stato spezzettato in vari frammenti essi possono essere separati attraverso la tecnica dell’elettroforesi. Elettroforesi processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita’. SEMINA Nota bene:a>b>c Le molecole piu’ grandi migrano piu’ lentamente di quelle piu’ piccole.

Il DNA viene digerito con le endonuclesai di restrizione I frammenti vengono applicati su gel di agarosio per l'elettroforesi Il DNA ha una carica negativa, e in un campo elettrico migra verso l'elettrodo positivo. La velocità di migrazione attraverso il gel è proporzionale alle dimensioni del frammento. Problema 3| Risposta | Problema 4 Glossario Il Progetto Biologico > Biologia Molecolare > DNA ricombinante Il Progetto Biologico University of Arizona Traduzione a cura del Prof. Erminio Terio - Università di Bari Contact the Development Team http://www.biology.arizona.edu All contents copyright © 1996-99. All rights reserved.

http://www.gene-abc.ch/lex/index_i.html

CLONAZIONE DEL DNA Il DNA del plasmidio e quello della cellula vengono tagliati con lo stesso enzima di restrizione. Uno dei plasmidi più utili è pSC101 che possiede solo una sequenza riconosciuta da EcoRI e quindi viene tagliato solo in un punto. Estremità coesive Si mettono insieme i frammenti di DNA della cellula e i plasmidi tagliati Si aggiunge l’enzima DNA-ligasi TRASFORMAZIONE dei batteri ( il batterio ha la capacità di inglobare i plasmidi presenti nel brodo di coltura) Il batterio si riproduce e da vita a milioni di cellule contenenti anche il plasmide ricombinato. Per isolare il gene della cellula basta ritrattare i plasmidi con l’enzima EcoRI

LIBRERIE GENOMICHE Problema: nel genoma di un organismo c’è un gene che interessa, ma non si sa dove è ubicato; come si può isolare? 1-a)Si prepara una serie completa di frammenti del genoma che contiene il gene. b)Anche il plasmide è tagliato con lostesso enzima di restrizione 2- Si mette tutto insieme e si aggiunge DNAligasi 3- Si induce la trasformazione dei batteri 4- Si fanno riprodurre i batteri: ci saranno ora tanti “libri” (batteri) che portano un determinato frammento di DNA

Problema: come si trova il gene che interessa? Si usa il metodo dell’IBRIDAZIONE del DNA con RNA marcato. Si consideri il caso che il gene da isolare contenga la sequenza TAGGCT.

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Problema: esiste un metodo alternativo alla clonazione dei batteri per creare tante copie di un gene? Questa tecnica richiede la conoscenza delle sequenze nucleotidiche di ciascuna estremità del DNA che si vuole clonare. Occorro i primer: corte sequenze di DNA a singola catena (circa 20-30 elementi. Prima si separano le due catene del DNA. Poi i primer si legano alle singole catene di DNA. Le brevi sequenze di DNA a doppia catena così formate servono alla polimerasi per iniziare il lavoro (duplicazione del DNA): aggiunge un elemento all'altro trasformando così il DNA a singola catena in DNA a doppia catena. http://www.gene-abc.ch/welt/tech/meth/gt050/001_i.html