Enzimi in Biochimica Clinica

Enzimi in diagnostica: esempi Enzima Alanina amminotransferasi Fosfatasi acida Fosfatasi alcalina Amilasi Creatina chinasi -glutammil transferasi Lattico deidrogenasi Sorgenti Danni epatici Prostata Ossa Pancreas Muscoli Fegato Varie sorgenti (vedi poi)

Gli enzimi presenti nel plasma sono stati distinti in due grandi categorie: - enzimi plasma specifici - enzimi non plasma-specifici. Gli enzimi plasma-specifici svolgono la loro funzione nel plasma (gli enzimi che regolano la coagulazione, la lipoproteina lipasi, la lectina-colesterolo aciltransferasi, etc.). Gli enzimi non plasma-specifici non esercitano nel plasma alcuna funzione fisiologica. Si distinguono in: - enzimi di secrezione che si trovano nel siero perché secreti da alcune cellule ghiandolari ( amilasi, lipasi, fosfatasi ) e vengono eliminati attraverso le vie biliari o attraverso le urine. enzimi legati al metabolismo cellulare che sono presenti nelle cellule in elevata concentrazione.

Alterazione dei livelli plasmatici dovuta a : Alterata sintesi Variazione della quantità di tessuto Variazione nella permeabilità cellulare Alterazione nella velocità di inattivazione/ degradazione Ostruzione di una normale via di escrezione Altri fattori che influenzano l’attività (inibitori, carenza di cofattori...)

Quando le strutture cellulari vengono danneggiate gli enzimi cellulari si liberano e si riversano nel circolo sanguigno. Un aumento della loro concentrazione nel campione può rappresentare un indice abbastanza preciso di un danno cellulare.

Transaminasi Le transaminasi sono enzimi ubiquitari, ma particolarmente abbondanti in fegato e muscolo striato, che catalizzano reazioni di trasferimento di un gruppo amminico da un aa. donatore su un -chetoacido accettore, secondo lo schema generale: AA1 + KA2  KA1 + AA2 Le transaminasi contengono un coenzima vitaminico, il piridossal fosfato (PLP), che durante la catalisi riceve il gruppo –NH2 dal Glu e diventa piridossamina fosfato (PMP) Il meccanismo catalitico richiede la formazione di una base di Schiff tra il gruppo aldeidico del PLP e il gruppo amminico dell’aa.

ALT, Alanina aminotransferasi (Sinonimo GPT): 0-35 U/L L’enzima è localizzato principalmente nelle cellule epatiche dalle quali fuoriesce in seguito a danni a carico della loro parete. E’ un indicatore abbastanza specifico di un danno epatico senza però chiarirne la causa. Esso catalizza la reazione reversibile: L-alanina + alfa-chetoglutarato ----------> piruvato + L-glutammato Per dosare l'ALT si utilizza una reazione accoppiata utilizzando l'enzima lattico deidrogenasi che agisce sul substrato piruvato prodotto dall'ALT. Quanto più acido lattico si forma dal piruvato ad opera della lattico deidrogenasi tanto più è presente l'ALT. Quindi la diminuzione di assorbanza a 340nm allo spettrofotometro misura l'attività enzimatica dell'ALT L-alanina + alfa-chetoglutarato ----------> L-glutammato + acido piruvico

Dosaggio accoppiato Si aggiunge un enzima ausiliario (LDH) e il NADH ALT, Alanina aminotransferasi (Sinonimo GPT): 0-35 U/L Esso catalizza la reazione reversibile: L-alanina + alfa-chetoglutarato ----------> piruvato + L-glutammato Si aggiunge un enzima ausiliario (LDH) e il NADH LDH Piruvato + NADH + H+ <=> Lattato + NAD+ Si segue la scomparsa del NADH a 340 nm

AST, Aspartato aminotransferasi (Sinonimo GOT): 0-35 U/L E’ contenuto in diverse cellule ma risulta particolarmente concentrato in particolari distretti delle cellule epatiche (mitocondri) e del tessuto muscolare e cardiaco. Il fatto che siano localizzati all’interno di subunità cellulari fa sì che si abbia , un rilascio più lento dell’enzima nel sangue a seguito di danni che coinvolgono il fegato, ma ciò indica anche un danno più grave alle cellule del fegato o dei muscoli. catalizza la reazione reversibile: L-aspartato + alfa-chetoglutarato ----------> ossalacetato + L-glutammato   Per dosare l'AST si usa l'enzima malato deidrogenasi che utilizza come substrato l'ossalacetato prodotto dall'AST. Quanto più acido malico si forma dall'ossalacetato ad opera della malato deidrogenasi tanto più è presente l'AST. Quindi la diminuzione di assorbanza a 340nm allo spettrofotometro misura l'attività enzimatica dell'AST. L-aspartato + alfa-chetoglutarato ----------> L-glutammato + ossalacetato  ossalacetato  + NADH + H + Malato + NAD+

Metodi accoppiati: A a 340 nm

La sigla NAD, "nicotinammìdeadenìndinucleotìde“, è un coenzima il cui ruolo biologico consiste nel trasferire gli elettroni, quindi nel permettere le ossido-riduzioni; esso svolge il suo importante ruolo tramite lo spostamento di atomi di idrogeno.

Es di isoenzimi sono LDH, CK, ALP, ACP Gli isoenzimi sono proteine che catalizzano la stessa reazione, ma presentano diversa carica elettrica, diversa solubilità, cioè diverse caratteristiche chimico-fisiche. La determinazione di una forma isoenzimatica è importante nella diagnosi di una specifica patologia. I metodi di studio degli isoenzimi possono essere: di tipo generale consentono di determinare l’attività e/o espressione di tutti i possibili isoenzimi presenti nel materiale biologico di tipo specifico diretti alla misura del singolo isoenzima di interesse diagnostico. Tra i metodi generali troviamo l’elettroforesi, la cromatografia, l’ elettrofocalizzazione. I metodi selettivi si basano sull’ inibizione selettiva di uno o più isoenzimi, seguita dalla misura dell’attività residua. Es di isoenzimi sono LDH, CK, ALP, ACP

Gli isoenzimi possono differire in: Parametri cinetici Specificità pH ottimale Caratteristiche di carica (pI) Sensibilità all’inibizione Sensibilità al calore (termostabilità)

Lattico deidrogenasi (LDH).(120-240 U\L) Enzima della glicolisi presente nella maggior parte dei tessuti e in concentrazione più elevata nel cuore, fegato, muscolo scheletrico, rene, eritrociti. E’ costituito da quattro monomeri (H, M) per cui può esistere in cinque isoenzimi che differiscono per caratteristiche chimico-fisiche utili per l’identificazione. L'isoenzima M4 (LDH5) è predominante nei muscoli e nel fegato, mentre H4 (LDH1) nel cuore e H3M1 (LDH2) negli eritrociti. L'isoenzima cardiaco (LDH1) è facilmente riconoscibile perché è in grado di catalizzare la trasformazione dell'α-idrossibutirrato in α-cheto-butirrato.

LDH (lattico deidrogenasi) Composta da 4 subunità di 2 tipi H (heart) e M (muscle) 5 possibili combinazioni LDH 1, LDH 2, LDH 3, LDH 4, LDH 5 Catalizza la reazione Ac. piruvico + NADH + H+  Ac. lattico + NAD+ H H M M H M H M

Isoforme LDH e prevalenza nei tessuti 5 4 3 2 1 rene 5 4 3 2 1 m. scheletrica 5 4 3 2 1 m. cardiaca 5 4 3 2 1 fegato 5 4 3 2 1 emazie

Valori elevati di LDH si osservano: Nell’infarto del miocardio In malattie epatiche In anemie emolitiche e anemia perniciosa Nella leucemia In malattie muscolari (es. distrofia muscolare).

Dosaggio degli isoenzimi dell’LDH Dosaggio dell’LDH Dosaggio degli isoenzimi dell’LDH La separazione degli isoenzimi avviene mediante elettroforesi su acetato di cellulosa. La striscia di carta viene messa a contatto con acido lattico e NAD al termine della reazione si forma piruvato e NADH. Quest'ultimo sviluppa colore sulle bande isoenzimatiche in presenza di appositi reagenti. L'intensità del colore è proporzionale alla quantità plasmatica di isoenzima.

Le fosfatasi sono una classe di enzimi idrolasi che catalizzano la rimozione di gruppi fosfato. In pratica, rappresentano i catalizzatori della reazione di defosforilazione. In relazione al pH in cui operano, si distinguono due tipi di fosfatasi: la fosfatasi acida (ACP) e la fosfatasi alcalina (ALP). Fosfatasi alcalina. La fosfatasi alcalina (AP) è una glicoproteina a struttura dimerica contenente zinco, che catalizza l'idrolisi a pH alcalino di numerosi fosfomonoesteri. Essa è specificatamente associata a membrane citoplasmatiche e microsomi delle cellule della mucosa dell'intestino tenue e del tubulo convoluto prossimale del rene, degli osteoblasti, degli epatociti e del sinciziotrofoblasto placentare. Prodotta dal tessuto osseo , fegato, intestino, placenta. Ne sono noti vari isoenzimi. AUMENTA nell’accrescimento e in gravidanza (cond. fisiologiche), e nell’epatopatie e nelle malattie osse (cond. patologiche).

Significato clinico della fosfatasi alcalina totale Valori normali: bambini fino a 15 anni <300 UI/L; ragazzi da 15 a 18 anni <400 UI/L; adulti <170 UI/L. I valori elevati di bambini e adolescenti sono dovuti al maggiore ricambio osseo. Valori superiori alla norma possono essere indice diartrite deformante, carcinoma biliare, epatite, malattia di Paget, metastasi epatiche e ossee, alterazioni delle vie biliari, mieloma, mononucleosi, osteomielite, rachitismo, sarcoidosi, fratture ossee, insufficienza renale, sarcoma osteogenico. Valori inferiori possono essere causati da anemia, età avanzata, ipotiroidismo, malnutrizione.

Combinazione di metodi immunologici, elettroforetici e di digestione enzimatica per distinguere le isoforme ossea ed epato- biliare di fosfatasi alcalina.

Creatin-fosfo-chinasi (CPK) Enzima deputato al trasporto dell’ATP dall’interno dei mitocondri al citoplasma delle cellule muscolari Si tratta di un enzima addetto alla produzione di energia (ATP) a partire dalla fosfocreatina Interno del mitocondrio Membrana mitocondriale Citoplasma fibrocellula muscolare ATP ATP ATP creatina creatina Fosforilazione ossidativa CPK Energia per contrazione CPK ADP ADP ADP fosfocreatina fosfocreatina

CPK - isoenzimi CPK formato da due diverse sub unità M (muscle) e B (brain) 3 possibili combinazioni isoenzimatiche (M-M M-B B-B) Contenuto nei tessuti: Muscolatura scheletrica 96 4 0% Muscolatura cardiaca 80 20 0% Cervello 96% M M B B

Gli isoenzimi della creatina chinasi Dimero costituito di subunità B (brain) e M (muscle) Nell’infarto aumentano precoce-mente CK totale, CK-MB(2) e CK-MM(3)

Determinazione CK–MB massa CPK totale con metodo cinetico CK-MB metodo cinetico con immuno-inibizione delle subunità M e valutazione delle % del CK-MB rispetto al totale CK-MB massa CK–MB massa Maggiore sensibilità del test immunochimico rispetto a quello di cinetica enzimatica Maggiore specificità dovuta ad Ab moc e mancanza di interferenze Vengono comunque dosate le quote di CK-MB massa provenienti dalla muscolatura scheletrica Marcatore sensibile, poco specifico

CK-MB massa Incremento tra 2-6 ore, picco 10-24 ore, rientro entro 3 gg. Utile (insieme alla Mioglobina) nelle prime 10 ore dall’inizio della sintomatologia Correla con estensione della zona infartuata

Differenza misurazione ponderale-funzionale Nella misurazione ponderale si misura la quantità di sostanza presente attraverso reazioni chimiche o immunochimiche indipendentemente dalla sua capacità di svolgere o meno la corretta funzione Nella misurazione funzionale si valuta l’attività della sostanza in esame non considerando eventuali molecole alterate e quindi non funzionanti

Metodi di misurazione Ponderale Funzionale Unità di misura espressa in peso/volume: mg/dL Moli/litro Ecc. Funzionale Unità di misura espressa in: Unità/Volume [U/L (misurazioni di cinetica enzimatica)] Tempo (misurazione coagulative) Ratio oppure % di attività rispetto a un campione di riferimento (misurazione coagulative rispetto a pool di plasmi di riferimento)

Esempi di diverse misurazioni Ponderali: Glicemia mg/dl Creatininemia mg/dl CEA ng/mL CK-MB massa ng/mL Troponina ng/mL Funzionali CPK U/L AST U/L Tempo di protrombina secondi

Esempio di utilizzo degli isoenzimi CK-MB ed LDH1 nella diagnosi di laboratorio dell’ infarto del miocardio Enzima Inizio Picco Basale CK-MB 4h 18h 48h AST 8h 24-48h 4 giorni LDH1 24h 3 giorni 12 giorni

Valutazioni cliniche e quadro enzimatico

Andamento temporale dei marcatori cardiaci CK-MB massa Myo cTpn 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 24 36 48 60

Gli enzimi sono proteine dotate di attività catalitica L’enzima accelera la velocità di formazione del complesso ES abbassando l’energia di attivazione E + S ES EP E + P L’attività enzimatica si esprime in unità, quantità di enzima che catalizza la conversione di una micromole di substrato per minuto in condizioni definite di temperatura, pH e concentrazioni di substrato.

Come si misura l’attività di un enzima ? Velocità di reazione: quantità di substrato trasformato nel tempo v = - d [S] / dT = d [P] / dT Si misura la variazione nel tempo di una qualsiasi grandezza correlata alla concentrazione del substrato o del prodotto

Che cos’è l’attività specifica Attività specifica = attività / quantità totale proteine

In quali condizioni fare i dosaggi?

Velocità iniziale La velocità dipende dal substrato, ma [S] cambia nel tempo (si consuma) per semplicità, la cinetica viene studiata in condizioni iniziali (tempo = 0) in queste condizioni, [S] >> [E] [P]  0 (la reazione inversa da P a S è trascurabile)

Precauzioni nei dosaggi enzimatici Substrati, tamponi, ecc. di alta purezza Anche la prep. enzimatica non deve contenere composti che interferiscono col saggio L’enzima dovrebbe essere stabile Controllo di pH e temperatura La velocità deve essere costante nell’intervallo considerato (v0) Reazioni accoppiate: enzima ausiliario puro e non limitante, se possibile con Km piccola Escludere/valutare la presenza di reazioni non enzimatiche