Rotore della centrifuga Omogenizzatore Fegato di ratto Frammenti di fegato in saccarosio isotonico TAMPONE STE Saccarosio 250 mM Tris 10 mM EDTA 1 mM pH 7.0-7.5. Rotore della centrifuga

CENTRIFUGAZIONE In un campo centrifugo le particelle sedimentano con velocità diversa a seconda delle diverse caratteristiche di densità, dimensione e forma. Fc = m w2 r Fc = forza centrifuga (dine) m = massa della particella (gr)  = velocità angolare (radianti/sec) r = distanza dall’asse di rotazione (cm)

r(t) m w a’ a O Fc

La velocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo (G), diretto radialmente verso l’esterno. G = w2 r Il campo centrifugo è spesso espresso come multiplo della forza gravitazionale terrestre (g=980 cm s-2), cioè come il rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo e il peso della stessa sottoposta alla sola forza di gravità. Esso viene quindi riportato in termini di campo centrifugo relativo (RCF) o, più semplecemente, come numero di g. RCF = 1.119 x 10-5 (rpm)2 r

ROTORI AD ANGOLO FISSO

ROTORI A BRACCI OSCILLANTI 

CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE La procedura consiste nel rimuovere classi differenti di particelle, presenti in una sospensione eterogenea, mediante successive centrifugazioni ad RCF crescenti. I centrifugazione II III lavaggio

CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE DEGLI OMOGENATI CELLULARI FRAZIONE NUCLEARE: Sedimento prodotto da una centrifugazione dell’omogenato a 600 g per 10 minuti FRAZIONE MITOCONDRIALE: Sedimento ottenuto centrifugando il sovranatante post-nucleare a 6000 g per 10 minuti FRAZIONE MICROSOMALE: Sedimento ottenuto centrifugando il sovranatante post-mitocondriale a 50000-100000 g per 60 min FRAZIONE SOLUBILE O CITOSOL: Sovranatante dell’ultima centrifugazione

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’ Il metodo consiste nel creare, in un tubo da centrifuga, una colonna di fluido la cui densità aumenta verso il fondo, al di sopra della quale viene stratificato il materiale da separare.

REALIZZAZIONE DEI GRADIENTI Cloruro di cesio Saccarosio Ficoll (polimero sintetico del saccarosio) GRADIENTI DISCONTINUI (pareti cellulari, organelli subcellulari, virus) 20% 15% 10% 5%

(proteine, ormoni, acidi nucleici, GRADIENTI CONTINUI (proteine, ormoni, acidi nucleici, subunità ribosomali) Formatore di gradienti o gradient maker