Intermediate Filaments Cytokeratin Mitochondria DNA Intermediate Filaments The intermediate filament (IMF) family consists of strong, rope-like polymers that complement the microtubule and microfilament cytoskeletons to confer great tensile strength and resiliency. These 8-12 nm diameter fibers (intermediate in diameter between microtubules and microfilaments) are present in the cytoplasm of cells from multicellular organisms but are actually composed of different protein subunits in different cell types. IMFs are extremely insoluble in vitro, and the protein subunits can be purified by cycles of disassembly with denaturing detergents and then assembly upon dialysis. In cells, however, remodeling is achieved by phosphorylation/dephsophorylation. http://www.microscopyu.com/galleries/fluorescence/cells/ptk2/ptk2exlarge3.html, cached 070219 PTK2 Cells stained for DNA (blue), cytokeratin IMF protein (green) and mitochondria (red) Text and image sources are included using the notes function of this file

FILAMENTI INTERMEDI Presenti soltanto in alcuni metazoi, fra i quali vertebrati, nematodi e molluschi anche in questi organismi non sono, comunque, necessari in tutte le cellule correlati alle lamine nucleari (proteine filamentose che formano un reticolo che ricopre la membrana interna dell’involucro nucleare, antenati dei filamenti intermedi) impartiscono forza fisica a cellule e tessuti Strutture dinamiche, la fosforilazione regola probabilmente il disassemblaggio. Famiglie diverse di filamenti intermedi, la più diversificata è quella delle CHERATINE, Una seconda famiglia è costituita dai NEUROFILAMENTI

Filamenti Intermedi Bastoncini resistenti e flessibili Circa 10 nm di spessore Protofilamenti Sub-unità proteiche arrotolate l’una sull’altra Solo organismi pluricellulari Composizione proteica e dimensioni variabili

Sostegno meccanico Abbondanti in zone di stress meccanico

Hanno un diametro di circa 10 nm (“intermedio” tra quello dei microfilamenti (7 nm) e quello dei microtubuli (25 nm)). Si sviluppano in modo particolare nel citoplasma di cellule sottoposte a stress meccanici (per esempio sono abbondanti lungo gli assoni delle cellule nervose e nelle cellule muscolari ed epiteliali). A) Gruppo di cellule epidermiche in coltura, colorate per evidenziare la rete di filamenti intermedi citoplasmatici. I filamenti di ogni cellula sono connessi indirettamente a quelli delle cellule vicine attraverso giunzioni cellulari specializzate dette desmosomi. B) Disegno che illustra i fasci di filamenti intermedi che attraversano il citoplasma e vanno ad inserirsi nei desmosomi. Sono presenti anche dentro il nucleo: lamina nucleare. Sono come cordami fatti di molti fili ritorti per dare resistenza alla trazione.

Filamenti Intermedi

Classi dei FI I classe II classe III classe IV classe V classe Cheratine Acide II classe Cheratine Basiche o Neutre III classe Vimentina, Desmina e GFA (proteina fibrillare acida della glia delle cellule nervose) IV classe Proteine dei Neurofilamenti (NF) V classe Lamine nucleari A, B e C

Cheratinociti Desmosomi e Tonofilamenti Rafforzano le zone sottoposte a stress meccanico

Epitelio di transizione IFs Filamenti intermedi particolarmente importanti L’epitelio di distende e ritrae continuamente Vescica

Supporto alla membrana cellulare Filementi intermedi a ridosso della membrana Ulteriore supporto ai microfilamenti di actina

Le proteine dei filamenti intermedi I filamenti intermedi sono presenti sia nel citoplasma che nel nucleo. Le proteine che li compongono sono molecole fibrose molto allungate, caratterizzate da un dominio centrale bastoncellare simile in lunghezza, sequenza e struttura (presenta una struttura secondaria ad alfa elica e contiene 310-318 amminoacidi), fiancheggiato da due estremità globulari di lunghezza e sequenza variabile (Figura 10). Le proteine dei filamenti intermedi sono numerose (nell’uomo ne sono state identificate almeno 50) e la loro classificazione si basa sulla distribuzione tissutale e su criteri biochimici, immunologici e genetici. Tipo Componenti I e II Cheratine acide e basiche III Vimentina; Desmina; Proteina gliale fibrillare acida (GFAP); Periferina IV Proteine dei neurofilamenti (NF-L, NF-M,NF-H); Nestina; Internexina> V Lamine A, B, e C Generalmente vengono raggruppate nelle seguenti classi:

The IMF Family Type Protein Human gene # Mol Weight Cell type Type I (acidic) Type II (basic) Keratins Keratins >15 >15 40-57 kDa 53-70 kDa Epithelia Epithelia Type III (vimentin-like) Vimentin Desmin GFAP Peripherin 1 1 1 1 57 kDa 54 kDa 50 kDa 57 kDa Mesenchymal cells Muscle Glia, astrocytes PNS neurons Type IV (neurofilaments) NF-L NF-M NF-H [alpha]-internexin 62 kDa 102 kDa 110 kDa 66 kDa CNS neurons CNS neurons CNS neurons CNS neurons Type V (nuclear lamina) Lamins A / C Lamins B1, B2 1 1 ea 70/63 kDa 67/72 kDa Nucleus - Mature cells Nucleus - Develop.cells * Lens (Type VI) Phakinin/CP49 Filensin 1 1 49 kDa 95 kDa Lens Lens Others: Nestin, Synemin, Paranemin, Plasticin, Tanabin... (Prokaryotic IMF family member) (Cresecntin) (Prokaryotes) form heterodimers Keratin proteins are expressed by epithelial cells. Keratin subunits are heterodimers composed of an acidic (type I) and a basic (type II) chain. Over 50 kinds of different keratins exist. Vimentin-like proteins (type III) are expressed by fibroblast, muscle, and glial cells. They form strong connections to intracellular junctions. Vimentin-like proteins include vimentin, desmin, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and peripherin. Neurofilaments (type IV) are expressed only in neurons. They have extended tail domains that crosslink the neurofilaments into regularly spaced arrays. Examples are neurofilament proteins, nestin, internexin Keratins, Vimentins, and Neurofilaments are only found in metazoa where they may have been an important evolutionary innovation that permitted multicellular organisms to develop (they help hold cells together). Interestingly, IMFs seem dispensable for growth of isolated cells in culture. All eukaryotic cells assemble a nuclear lamina composed of Lamin proteins (type V) that share characteristics with intermediate filament proteins and may represent an ancestral form from which cytoplasmic intermediate filament proteins diverged. The recent (2005) discovery of crescentin in in the prokaryote Caulobacter, and the realization that crescentin shares features of intermediate filament proteins has opened the door to both an origin of the IMF protein family and perhaps a root for the tree. There is an additional “catch all” class VI (split by some into multiple classes) that includes IMF relatives that assemble into a special class of cytoplasmic filaments in yeasts (septins) as well as minor components of the ocular lens; and an “other” category for proteins that share a distant likeness to IMF proteins. Adapted from http://www.hopkinsmedicine.org/CoulombeLabPage/intermediate.htm , cached 070218

il filamento intermedio assemblato è privo di polarità strutturale Monomeri: molecole filamentose con dominio centrale esteso ad a-elica. Dimeri: il dominio a-elica di due monomeri forma un coiled coil parallelo. Tetramero: una coppia di dimeri si associa in modo antiparallelo e sfalsato. Il tetramero rappresenta la subunità solubile. Protofilamento: i tetrameri si uniscono insieme lateralmente. Filamento: associazione di 8 protofilamenti paralleli. il filamento intermedio assemblato è privo di polarità strutturale Ogni filamento intermedio ha una sezione trasversale di 32 singoli avvolgimenti ad a-elica

Composizione e struttura dei filamenti intermedi   I filamenti intermedi sono polimeri stabili, cordonali di proteine fibrose. Il monomero proteico dei filamenti intermedi è una proteina fibrosa allungata, composta da un domino centrale bastoncellare e una regione globulare a ogni estremità.(A) I monomeri si accoppiano in dimeri stabili avvolgendosi l’uno sull’altro in una conformazione a spirale ritorta (B) e due dimeri si associano, sfalsati ed antiparalleli, in un tetramero per mezzo di legami non covalenti (C); infine i tetrameri si uniscono testa a coda (D) formando tanti fili che poi si associano non covalentemente generando un fascio ritorto che costituisce il filamento intermedio finale a cordone (E). Si ritiene che l’unità di assemblaggio di base sia il tetramero.

L’assemblaggio non è accompagnato dall’idrolisi di nucleotidi L’assemblaggio non è accompagnato dall’idrolisi di nucleotidi. I domini bastoncellari delle varie proteine che compongono i filamenti intermedi sono tutti simili per dimensioni, sequenza amminoacidica e struttura. Invece le regioni globulari variano molto da un filamento intermedio all’altro rendendo specifiche le interazioni con altri componenti citoplasmatici

Assembly as simple as abcdefg central rod domain Intermediate filament proteins have a common multidomain secondary structure Central alpha-helical rod domain (~310 aas) conserved in group (30-50% aa homology) characteristic heptad repeat (abcdefg where a and d are hydrophobic aas, charged aas in keratins) form a coiled-coil backbone some form only homopolymers; others form mixed heteropolymers responsible for extensive, lateral, hydrophobic interactions that create great strength Non-alpha helical head and tail domains widely divergent functionalize filament - interaction domains that interface to other cellular components IMF proteins do not contain nucleotide binding sites (no “classic” dynamic instability, treadmilling) Polymerization: Two monomers join in parallel to make a Dimer Two dimers join in antiparallel to make an apolar Tetramer Eight tetramers join into a 16 nm diameter unit length protofilament (ULF) some models incorporate lateral overlaps (by 1/3) offset end-to-end junctions filament compaction (annealing) optimizes contact for tight associations (diameter decreases to 10nm) Note that the apolar nature of the fundamental tetrameric unit means that unlike microtubules and microfilaments there is no overall polarity intrinsic to an intermediate filament. This is likely why no intermediate filament motors are known (they would not be able to “read” which way to move progressively). Depolymerization in vivo: phosphorylation appears to cause networks to disassemble (best understood for the nuclear lamins) http://www.interfil.org/intro.php, cached 060212 Coiled-coil diagram from http://www.new-science-press.com/info/illustration_files/nsp-protein-1-19-1_67.jpg bundles of 8 tetramers

Atomic Model of the Dimer The polar dimer is joined by an extensive colied-coil region with a characteristic heptad repeat of hydrophobic residues. This representation was made by “pasting” together three substructures determined for Vimentin, but emphasizes characteristics common to all IMF proteins. Two dimers join laterally in an antiparallel arrangement to create an apolar tetramer Lenghwise interactions are controlled by the end domains; structural studies show that the amino terminal “Heads” can fold back to form a non-interactive state, or project forward in an “open” configuration to engage the end of an existing filament. http://www.biozentrum.unibas.ch/~burkhard/IF_EMBO.jpg , cached 070219

ormation of the protofilament.

I filamenti Intermedi Citoplasmatici I filamenti intermedi che si trovano nel citoplasma si possono raggruppare in tre classi: 1) i filamenti di cheratina delle cellule epiteliali; 2) la vimentina e i filamenti vimentino-simili delle cellule connettivali, muscolari e neurogliali; 3) i neurofilamenti delle cellule nervose. La tipizzazione dei filamenti intermedi citoplasmatici è particolarmente utile in medicina per la diagnosi dei tumori, in quanto le cellule tumorali mantengono i filamenti intermedi caratteristici del tessuto di origine, indipendentemente dalla localizzazione del tumore nel corpo. I filamenti di cheratina sono caratteristici delle cellule epiteliali che ricoprono la superficie del corpo e le sue cavità.

Vimentin in Fibroblasts This typical appearance of vimentin IMF networks in fibroblast cells in culture Image from http://www.ii.bham.ac.uk/clinicalimmunology/CISimagelibrary/images/Fig%2065%20vimentin.JPG , cached 060211

La classe delle cheratine è la più diversificata: esistono più di 20 tipi di cheratine e nei vari epiteli si trovano gruppi diversi. Inoltre, cheratine specializzate si trovano nel pelo, nelle unghie e nelle piume. Mutazioni dei geni che codificano per le cheratine possono causare gravi malattie genetiche, quale l’epidermolisi bollosa simplex).

L’ epidermolisi bollosa simplex è una malattia genetica dell’uomo in cui mutazioni di geni delle cheratine che sono espresse nello strato cellulare basale dell’epidermide interferiscono con la formazione dei filamenti cheratinici in queste cellule: la pelle risulta vulnerabilissima ai danni meccanici e anche una pressione moderata può danneggiarne le cellule e indurre la formazione di bolle. I filamenti di vimentina sono presenti nei tessuti connettivi ed in altri tipi cellulari di origine non epiteliale. I filamenti di desmina sono presenti nelle cellule muscolari.

I filamenti di GFA sono caratteristici delle cellule dell’astroglia. A) Fotografia al microscopio elettronico dei neurofilamenti dell’assone di un neurone. B) Fotografia al microscopio elettronico dei filamenti intermedi di una cellula gliale dell’assone di un neurone. C) Fotografia al microscopio elettronico di una sezione trasversale di un assone. Si può notare la distribuzione regolare dei neurofilamenti ed il loro numero elevato rispetto ai microtubuli. I neurofilamenti sono presenti lungo i prolungamenti delle cellule nervose (Figura 13).

I Filamenti Intermedi Nucleari I filamenti intermedi che rivestono e irrobustiscono la faccia interna della membrana nucleare non si possono paragonare a corde come quelli citoplasmatici ma somigliano di più a un tessuto bidimensionale.

I filamenti intermedi della lamina nucleare sono costituiti da proteine del gruppo delle lamine. Mentre i filamenti intermedi citoplasmatici sono stabilissimi in molte cellule, quelli della lamina nucleare si disaggregano e si ricostituiscono a ogni divisione mitotica.