RADICALI LIBERI Il temine radicale chimico (1832), indicava un gruppo di atomi, appartenente ad una molecola di un composto organico (CH3-, radicale metile; C2H5-, radicale etile) Il primo radicale preparato (1900) fu il trifenilmetile (C6H5)3C Radicale libero (R) è una specie chimica capace di esistenza indipendente, con uno o più elettroni spaiati nei suoi orbitali. Sono radicali l’idrogeno atomico (H) e quasi tutti i metalli del gruppo di transizione nella tavola periodica

Proprietà dei radicali liberi  I radicali liberi sono paramagnetici in quanto il numero magnetico totale dei loro elettroni è diverso da zero.  I radicali sono generalmente più reattivi delle specie non radicaliche poiché gli elettroni sono più stabili quando sono accoppiati  La capacità di alcuni radicali di reagire con estrema velocità rende tali specie estremamente evanescenti e di difficile rilevazione I radicali comprendono anche specie chimiche relativamente stabili come l’ossido nitrico (NO), il biossido di azoto (NO2) e l’ossigeno (O2 )

 Trasferimento di un elettrone REAZIONI RADICALICHE Fase iniziale:  Trasferimento di un elettrone  Rottura omolitica di un legame covalente Fase di propagazione:  Addizione ad un’altra molecola  Cessione di un elettrone ad un’altra molecola  Accettazione di un elettrone da un’altra molecola  Estrazione di idrogeno da un legame C-H Fase terminale:

Velocità delle reazioni radicaliche  Reazioni fra radicali si verificano quando i reagenti si incontrano (Processi controllati dalla diffusione)  Il valore di k dipende da vari parametri, fra cui la stabilizzazione interna del radicale In reazioni fra radicali e molecole, k è influenzato dall’energia del complesso attivato

TOSSICITA’ DELL’OSSIGENO O2 è tossico ad alte concentrazioni si rileva in: La pO2 aumenta per: Aumento del % di O2 nell’aria inspirata (uso di O2 iperbarico) Aumento della pressione totale (immersioni sottomarine) La tossicità di O2 si rileva in:  Lesioni della retina di prematuri trattati con O2 in incubatrici (retinopatia del prematuro)  Irritazione delle vie respiratorie  Convulsioni di tipo epilettico

Danni da O2 Ossigeno iperbarico Ad alte pO2 (4,6 atm) si evidenziano sintomi di intossicazione del sistema nervoso in pochi minuti L’esposizione ad O2 puro (p = 1 atm), causa tracheite e tosse in poche ore, danno agli alveoli polmonari in un giorno, morte per ipossia in alcuni giorni. Immersioni Nell’immersione la pressione aumenta di 1 atm per ogni 10 metri di profondità L’O2 puro riduce i disturbi da decompressione, ma è tossico per il sistema nervoso sotto i 10 metri (pO2 > 2 atm) L’aria contenente il 21% di O2 ha una pO2 di 1 atm a 40 m, ed è sopportata per tempi brevi A 140 metri la pO2 è 3,15 atm e danneggia il sistema nervoso in 1-2 ore, per cui a grandi profondità il % di O2 deve essere ridotto

Struttura dell’O2 Radicali con 2 e- spaiati sono nello stato di tripletto (spin 1) o di singoletto (spin 0) ad energia diversa L’O2 è un biradicale che si trova nello stato di tripletto L’3O2 può essere eccitato a stati di singoletto ad E maggiore (1gO2, E =23 kcal/mole; 1g+O2, E = 37 kcal/mole)

Reattività dell’ossigeno Il danno da O2 fu attribuita ad inattivazione enzimatica L’O2 è poco reattivo. Gli elettroni spaiati sono difficili da accoppiare con gli elettroni delle molecole organiche che sono antiparalleli (restrizione di spin) La restrizione potrebbe essere eliminata formando 1O2 Si riteneva che la citocromo ossidasi (COX) cedesse gradualmente 4 elettroni all’O2 e gli intermedi di riduzione fossero saldamente legati al suo sito attivo

ROS E RNS Le specie parzialmente ridotte dell’O2 non hanno i suoi impedimenti cinetici e sono definite specie reattive dell’ossigeno (ROS) Specie reattive dell’ossigeno (ROS) Radicali O2- Radicale superossido OH Radicale ossidrile RO Radicale alcossile ROO Radicale perossile Non radicali H2O2 Perossido di idrogeno HOCl Acido ipocloroso 1O2 Ossigeno singoletto O3 Ozono Specie reattive dell’azoto (RNS) NO Ossido nitrico NO2● Biossido d’azoto HNO2 Acido nitroso N2O4 Tetrossido d’azoto ONOO- Perossinitrito

Riduzione univalente dell’ossigeno Nel 1954 fu proposto che gli effetti dannosi dell'O2 erano dovuti alla formazione dei suoi radicali L’ipotesi, con la scoperta della SOD, portò alla "teoria del superossido”, secondo cui la tossicità dell'O2 era dovuta alla formazione di O2- e la SOD era importante per la difesa cellulare Tuttavia O2- non è molto aggressivo, ma può portare alla formazione di altre ROS In ambiente acido O2- genera H2O2 per dismutazione spontanea., ma in presenza della SOD la dismutazione si verifica a velocità 104 volte più alta H2O2 non è in grado di ossidare DNA, lipidi e la maggior parte delle proteine in ambiente acquoso

H2O2 può essere citotossico e, ad alte concentrazioni, è usato come disinfettante Gli effetti sui batteri sono dovuti alla capacità dell’H2O2 di generare il radicale OH estremamente reattivo H2O2 reagisce con ioni metallici di transizione in for-ma ridotta formando OH (Reazione di Fenton): OH è responsabile del danno ossidativo a DNA, lipidi e proteine La reattività di OH può essere valutata dalla sua mezza vita a 37°C OH 1· 10-9 sec O2- 1·10-6 sec 1O2 1·10-6 sec 3O2 > 102 sec

Reazioni di ●OH Estrazione di idrogeno Un esempio è l’estrazione di H da un alcool con formazione di H2O e di un radicale idrossialchilico: Il radicale può reagire ulteriormente con O2 dando un radicale perossilico: Addizione L’OH può anche addizionarsi a doppi legami

Ossido nitrico L’ossido nitrico (NO) è sintetizzato per azione delle NOS, che convertono l’arginina in NO e citrullina  Esposto all’aria, NO reagisce con O2 formando il gas bruno diossido di azoto o ipoazotide ( NO2 ) che è un radicale molto più reattivo di NO L’ossidazione di NO in soluzione acquosa produce principalmente lo ione nitrito (NO2-): NO reagisce con Fe2+ dell’eme (k < 108 M-1s-1) NO non è molto reattivo ma può essere convertito a a perossinitrito (ONOO-) reagendo con il superossido ONOO- provoca deplezione di gruppi –SH, ossidazione di lipidi, rottura delle eliche e nitrazione di basi del DNA, nitrazione di residui di aminoacidi

PRODUZIONE DI RADICALI LIBERI Gli organismi aerobi sono sottoposti ad un attacco continuo da parte di radicali liberi derivanti da fonti esogene ed endogene AGENTI ESTERNI Radiazioni elettromagnetiche Particelle atomiche Inquinanti ambientali SITI DI PRODUZIONE INTERNi Mitocondri (catena respiratoria) Citoplasma (xantina ossidasi) Microsomi (P450-b5) Membrana (lipoossigenasi) Perissosomi (enzimi ossidasi) Fagociti (NADPH-ossidasi)

Radiazioni Le radiazioni influenzano processi vitali (fotosintesi, fotoperiodismo, ritmi circadiani, visione, formazione della vitamina D) Le radiazioni sono anche responsabili di eventi patologici che a volte coinvolgono radicali liberi: Le radiazioni luminose inducono l’azione fotodina-mica Le radiazioni ultraviolette provocano l’eccitazione di molecole che possono dissociarsi formando radicali liberi Le radiazioni ionizzanti sono:  corpuscolari (elettroni, protoni, neutroni, particelle  e particelle ) ed elettromagnetiche (raggi x e raggi )

Negli organismi viventi le radiazioni ionizzanti formano radicali primari trasferendo energia a componenti cellulari ed in particolare all’acqua, che subisce ionizzazione ed eccitazione. L’elettrone è rapidamente idratato lo ione radicalico si decompone la molecola eccitata subisce fissione omolitica dando l’atomo di idrogeno ed il radicale ossidrile I radicali primari (OH, H, ed e-aq), diffondono e reagiscono con vari soluti cellulari generando nuove specie chimiche

Inquinanti ambientali Una causa di danno cellulare è NO●2, formato dalla reazione di N2 con O2 nella combustione di materiale organico. La reazione può dare NO●, ma questo forma NO●2 reagendo ancora con O2 NO●2 è molto reattivo e la sua formazione è motivo di preoccupazione Nelle città occidentali, la principale sorgente di NO●2 è l’emissione degli scarichi dei veicoli NO●2 è pericoloso anche perché è un precursore di O3, il maggiore responsabile dello smog fotochimico

Formazione di O3 O3 si forma in reazione a due fasi favorita da irraggiamento solare e T elevata: O3 si forma in aree inquinate nelle giornate estive O3 subisce una reazione di abbattimento riformando i prodotti di partenza La reazione è indipendente dalla luce, per cui si ha di notte ed è minore in campagna  O3 provoca ossidazione di metalli e depolimerizza-zione e degradazione di plastiche e gomme  interferisce con la funzione clorofilliana e la crescita delle piante  irrita e infiamma occhi e prime vie respiratorie. I fenomeni, dopo esposizioni prolungate, provocano danni irreversibili al sistema respiratorio e cardio-vascolare

Il fumo delle sigarette contiene ~3000 composti, molti dei quali tossici (nicotina, CO, benzene, HCN, radicali liberi, aldeidi, nitrosammine e benzopirene). Il fumo è separabile in una fase gassosa e nel catrame. Il catrame contiene circa 107 radicali/g, per lo più molto stabili, fra cui semichinoni che subiscono interconversioni con chinoni ed idrochinoni Estratti acquosi di catrame generano il radicale superossido, probabilmente per reazione dei semichinoni con O2 La fase gassosa contiene per ogni boccata più di 105 radicali (alcossilici, perossilici e centrati sul carbonio) con vita più breve

Catena respiratoria mitocondriale Il 95% dell’O2 è utilizzato dai mitocondri Le sostanze contenute negli alimenti sono ossidate cedendo elettroni a trasportatori di elettroni come NAD+, FMN e FAD. I prodotti della reazione sono riossidati dall’O2 nei mitocondri, producendo ATP L’ossidazione si verifica in tappe successive, che coinvolgono centri redox organizzati in 4 complessi immersi nella membrana interna. Gli H+ sono espulsi dai mitocondri e l’energia conservata nel gradiente protonico guida la sintesi di ATP attraverso il processo di fosforilazione ossidativa

Riduzione tetravalente dell’O2 Gli elettroni dal NADH passano nel complesso I a proteine Fe-S, convertendo Fe3+ a Fe2+. Il passaggio degli elettroni al successivo accettore provoca la riconversione di Fe3+ a Fe2+ Gli elettroni sono trasferiti al Complesso III attraverso il Coenzima Q, che trasferisce anche gli elettroni derivanti dalla ossidazione, nel Complesso II, del succinato a fumarato Nel Complesso III gli elettroni sono trasferiti mediante citocromi in cui il ferro passa alternativamente tra gli stati +2 e +3 Gli elettroni passano al citocromo c legato alla superficie esterna della membrana interna, che li porta al Complesso IV (COX) La COX rimuove 1 elettrone da ciascuna di 4 molecole di citocromo c e cede i 4 elettroni ad O2 formando H2O

Generazione mitochondriale di ROS Componenti della catena respiratoria cedono un elettrone all’O2 (riduzione univalente) trasformandolo nel radicale O2- Il superoosido è, a sua volta, trasformato in H2O2 dalla SOD della matrice La velocità della produzione delle ROS aumenta ad alte pO2 Usando particelle submitocondriali fu calcolato che circa il 2% dell'O2 è trasformato in ROS, mentre con ADP queste non si formavano Lavori più recenti suggeriscono che il valore è più basso e che l’aggiunta di ADP non riduce a zero la produzione di ROS

Velocità di produzione delle ROS I mitocondri producono ROS a velocità che dipendono dal loro stato metabolico La velocità è più alta durante lo stato 4 e più bassa durante lo stato 3 Infatti la formazione di O2- è controllata dall’azione di massa: A parità di pO2, aumenta col crescere della concentrazione dei carriers mitocondriali nella forma ridotta L’energia degli elettroni, che fluiscono attraverso la catena respiratoria, è convertita in gradiente di H+, che è dissipato attraverso l’ATP sintetasi formando ATP In assenza di ADP, il movimento di H+ attraverso l’ATP sintetasi cessa, il gradiente di H+ aumenta rallentando il flusso elettronico e come conseguenza aumenta il grado di riduzione della catena respiratoria e la velocità di produzione di O2-

Sistemi di trasporto elettronico microsomali Sul reticolo endoplasmatico vi sono due sistemi di trasporto elettronico Metabolismo degli xenobiotici Il metabolismo degli xenobiotici può essere suddiviso in due fasi: Le reazioni della Fase I introducono un gruppo polare in substrati lipofili Le reazioni della Fase II sono reazioni di coniugazio-ne: una molecola endogena è addizionata al prodotto della reazione della Fase I, a volte direttamente allo xenobiotico. Esempi di reazioni della Fase II sono le coniugazioni con GSH catalizzate da GST Le reazioni della Fase I, oltre al substrato (AH), richiedono un riducente (RH2)

Ciclo del P450 Il sistema coinvolto nella fase I è costituito da una NADPH-citocromo P450 riduttasi e da citocromi P450 Frazioni microsomali, incubate con NADPH, producono ROS in due modi:  intermedi del ciclo sono cortocircuitati e O2 è ridotto a O2- e H2O2 (disaccoppiamento dell’attività ossidasica del P450) flavine nell’enzima NADPH-P450 riduttasi nella forma semichinonica radicalica cedono elettroni a O2

Sistema desaturasi L’altro sistema, in cui gli elettroni vanno dal NADH al cit b5, introduce doppi legami C=C negli acidi grassi (desaturazione) Esso è costituito da una NADH-citocromo b5 reduttasi, il citocromo b5, e l’enzima desaturasi La prima proteina catalizza il trasferimento di elettroni dal NADH al b5 che li dona all’enzima desaturasi Questa (chiamata fattore sensibile al cianuro) contiene un ferro non emico per catena polipeptidica e desatura l’acilCoA ad enoilCoA riducendo O2 ad H2O Citocromo b5 e flavoproteina possono ridurre O2 a O2-●

I sistemi di detossificazione e di desaturazione sono interconnessi La flavoproteina del I sistema (FpI), in alcuni casi, può ridurre il citocromo b5. Il complesso P450-(RH)-Fe3+ può accettare un elettrone dal NADPH attraverso FpI o dal NADH attraverso il citocromo b5

Perossidazione lipidica I PUFA dei fosfolipidi subiscono un processo a catena (perossidazione lipidica), che è innescato da qualsiasi radicale che è in grado di estrarre un H da un gruppo metilenico

Prodotti della perossidazione lipidica La perossidazione è un processo autocatalitico, capace di convertire diverse centinaia di acidi grassi in idroperossidi, a meno che la fase di propagazione non sia interrotta da un antiossidante cedendo un H● a ROO● A causa di reazioni di frammentazione della catena, che coinvolgono radicali perossilici, si ottengono prodotti secondari: idrocarburi, esteri, aldeidi, chetoni, alcoli, acidi, epossidi, a cui è dovuto l’odore di rancido dei grassi ossidati

Conseguenze della perossidazione lipidica Perdita di grassi polinsaturi Diminuzione di fluidità lipidica Alterazione della permeabilità della membrana Danni agli enzimi associati alla membrana Alterato trasporto ionico Produzione di metaboliti tossici degli idroperossidi

Danni alle proteine H2O2 ha effetto solo sui gruppi –SH a differenza di OH Gli intermedi radicalici possono reagire con altre proteine generando un nuovo radicale carbonilico e propagando la reazione In assenza di O2, la reazione 1 non si verifica, e due radicali possono reagire formando un derivato proteina-proteina

Con radicali derivanti dalla ossidazione di lipidi e proteine si producono aggregati proteina-lipide: Il legame C-C del radicale alcossilico (reazione 4) si può rompere con frammentazione della proteina I prodotti carbonilici, derivati dalla degradazione dei perossidi lipidici, interagiscono con i residui amino-acidici delle proteine alterandone la natura e la carica elettrica. La MDA può legare due proteine producendo basi di Schiff coniugate rivelabili per fluorescenza

Danno ossidativo al DNA L’OH può modificare le basi del DNA o scindere l’elica del DNA L’ossidazione in vitro porta a forme di DNA danneggiato e basi alterate La presenza nei tessuti e l'escrezione con l'urina di tali basi indica un danno in vivo del DNA