Rapporto microorganismi organismi pluricellulari

Steps in successful infection

Steps in successful infection Sex comes before disease acquire virulence genes Sense environment and Switch virulence genes on and off Swim to site of infection Stick to site of infection Scavenge nutrients especially iron Survive stress Stealth avoid immune system Strike-back damage host tissues Subvert host cell cytoskeletal and signalling pathways Spread through cells and organs Scatter

Azione patogena dei batteri COLONIZZAZIONE e MOLTIPLICAZIONE nell’OSPITE Adesione Moltiplicazione batterica Colonizzazione Invasione tessuti “Escape”difese DANNO OSPITE Produzione di tossine Produzione di mediatori flogosi - Reazioni autoimmunitarie

Bacterial Sex per acquisire geni di virulenza Batteri hanno 3 strategie per scambiare DNA Trasformazione cells take up naked DNA Trasduzione phages carry DNA Coniugazione cells mate through specialised appendages

Bacterial Sex elementi genetici mobili Trasposoni ST enterotoxin genes Plasmidi di Virulenza e.g. TTSSs in Shigella, Yersinia; toxins in Salmonella, E. coli, anthrax Fattori di virulenza codificati da fagi e.g. botulinum toxins, diphtheria toxin, shiga-like toxin (linked to lysis), staphylococcal toxins, TTSS substrates in Salmonella.

Bacterial Sex isole di patogenicità Concetto originato da studi su ceppi di E. coli uropatogenici Elementi caratterizzanti Presenza di (molti) geni di virulenza Presenza in ceppi patogeni ma non in ceppi apatogeni Differente contenuto in G+C ripsetto al cromosoma dell’ospite Occupano larghe regioni del cromosoma (10-100 Kb) Compatta unità genetica, spesso fiancheggiata da DRs, tRNAs, ISs Presenza di geni coinvolti nella mobilità Instabile, proni alla delezione Spesso codificano sistemi di secrezione (regione LEE in EPEC, Spi1, Spi2 in Salmonella, Cag in H. pylori) - Spesso codificano adesine, siderofori, tossine (Enteropathogenic E. coli (Pai I, II, IV, V), Yersinia spp. (HPI), V. cholerae (VPI or TCP-ACF element)

Sense environment Batteri possono avvertire cambiamenti nell’mbiente e.g. temperatura, disponibilità di nutrienti, osmolarità, densità cellulare (“quorum sensing”). Nei casi più semplici, cambiamenti nella concentrazione intracellulare di ioni sono direttamente legati all’espressione genica e.g. fall in intra-cellular iron levels triggers de-repression of diphtheria toxin gene Nei casi più complessi, sofisticate cascate di trasduzione del segnale consentono al batterio di regolare l’espressione di geni in risposta a cambiamenti ambientali the pathogen as an information processor

Switch virulence factors on and off A multi-layered hierarchy Modificazioni nella sequenza del DNA Amplificazione genica Riarrangiamento genico e.g. Hin flip-flop control of flagellar phase variation Regolazione Transcrizionale Attivatori e Repressori (helix-turn-helix motif) mRNA ripiegamento e stabilità Regolazione Translazionale Regolazione Post-translazionale Stabilità delle proteine, proteolisi controllata Modificazioni covalenti e.g. fosforilazioni in sistemi a due-componenti sensore-regolatore

Swim Molti batteri patogeni sono mobili Enterics, Campylobacter, Helicobacter, spirochaetes Mobilità è cruciale per la virulenza in alcuni casi Tipico organello di motilità = flagello Varianti Twitching motility Swarming

Disseminazione Enzimi batterici degradano differenti matrici tessutali. Sono considerati INVASINE Ialuronidasi (streptococchi, staphylococchi, clostridi). Collagenasi (Clostridium histolyticum and Clostridium perfringens). Neuraminidasi (Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae). Streptochinasi and Stafilochinasi (streptococchi and stafilococchi)

Stick Conferisce al microrganismo capacità di resistere alla rimozione meccanica operata sulle mucose e tropismo tissutale Comuni meccanismi di aderenza Capsula e slime Biofilm Adesine Gram-positivi MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules), e.g. protein A Fimbrie Adesine Gram-negativi (CHO and protein receptors) Fimbrie, Afimbrial adhesins (FHA, Pertactin etc.) Outer Membrane Proteins Types III-IV secretion

Colonizzazione La colonizzazione è la fase successiva all’adesione e comporta la moltiplicazione batterica Espressione genica programmata: “quorum-sensing” Per moltiplicarsi, un batterio deve: trovare un ambiente nutrizionale favorevole (temperatura, pH, scambi gassosi, osmolarità, nutrienti essenziali, tra cui ferro) superare le difese dell’ospite

Biofilm Protezione in ambienti ostili (matrice eso-polisaccaridica) Organizzazione simil-tissutale: canali di nutrizione interni pattern di espressione genica diversi Alternanza di stati di vita comunitaria e vita planctonica Ruolo fondamentale dei flagelli e pili nelle prime fasi di adesione (monolayer e microcolonie) “structured community of bacterial cells enclosed in a self-produced polymer matrix and adherent to an inert or living surface” (Costerton et al., Science, 1999)

Biofilm sulla superficie di un catetere Biofilm sulla mucosa ileale

Adesione batterica nel cavo orale e formazione della placca

Biofilm e infezioni Resistenti all’azione di anticorpi e fagociti. Naturalmente resistenti ad antimicrobici Causa frequente di infezioni croniche e persistenti, soprattutto da parte di patogeni opportunisti: P. aeruginosa e polmoniti in pazienti con CF GAS e fascite necrotizzante Streptococchi viridanti ed endocarditi Streptococchi orali e carie Batteri anaerobi orali e periodontopatie Infezioni nocosomiali da S. epidermidis, S. aureus, Actinomyces, Streptococcus

Scavenge nutrients e.g. iron Livelli di Fe libero nei fluidi corporei è molto basso Reazioni inf. acute causano una ulteriore riduzione Sovraccarico di Fe aumenta suscettibilità alle infezioni I batteri possiedono vari meccanismi per ottenere Fe Siderofori chelano Fe disponibile e lo trasportano interno batteri Fe può essere ottenuto direttamente da proteine ospite in grado di legarlo e.g proteine leganti la lattoferrina Alcuni patogeni evitano il problema riducendo la necessità di Fe, e.g. Treponema pallidum Fe è utilizzato per regolare l’espressione di fattori di virulenza Tossina difterica (DtxR repressore) Shiga-like tossina Pseudomonas aeruginosa esotossina A

Survive Stress Oltre allo stress derivante dalla mancanza di nutrienti, I patogeni devono affrontare molti altri stress Acidità nello stomaco Shock termico con la febbre Stress ossidativo nei fagociti Proteine prodotte in risposta a Stress, come le chaperonine, appaiono degli antigeni immunodominanti Proteine con attività detossificante giocano un ruolo nella virulenza, e.g. Cu,Zn-superossido dismutasi nello spazio periplasmico Dose infettiva per patogeni enterici in pz con acloridria

Stealth evitare (escape) il sistema immune IgA proteasi metalloproteasi attive contro IgA Proteine leganti le Immunoglobuline e.g. proteina A dello S. aureus Resistere all’azione del complemento, opsonizzazione Capsula (generalmente polisaccaridica) Lipopolisaccaride Proteine di superficie Mimicrismo antigenico e.g. capsula di acido sialico per il meningococco di gruppo B Legame proteine ospite

Variazione di fase o antigenica Coinvolge strutture di superficie come proteine, LPS, capsula Varietà di meccanismi slip-strand mispairing flip-flop cassette Crescere in fagociti in biofilm 67700 67710 67720 GAAGTGCATTTAACTT**GGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT*GGGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTTGGGGGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT***GGGGGGGGGGTAAT GAAGTGCATTTAACTT****GGGGGGGGGTAAT Homopolymeric tract in Campylobacter jejuni

Strategie usate dai batteri intracellulari Blocco maturazione fagosoma (Legionella, Mycobacterium, Salmonella, Chlamydia) Adattamento e replicazione in compartimenti lisosomiali (Coxiella) Escape nel citosol (Listeria, Shigella)

Patogeni extracellulari ed intracellulari

Shigella Salmonella

Azione patogena dei batteri COLONIZZAZIONE dell’OSPITE Adesione Moltiplicazione batterica Colonizzazione Invasione “Escape”/sovversione delle Difese Immunitarie DANNO DIRETTO all’OSPITE Produzione di tossine Produzione di molecole infiammatorie Reazioni autoimmunitarie

Opsonizzazione

Inibizione della fagocitosi

Inibizione della fagocitosi

Inibizione dell’azione del complemento

Azione patogena dei batteri COLONIZZAZIONE e MOLTIPLICAZIONE nell’OSPITE Adesione Moltiplicazione batterica Colonizzazione Invasione “Escape”/sovversione delle Difese Immunitarie DANNO TESSUTI OSPITE Produzione di tossine Produzione di molecole che inducono una risposta infiammatoria Reazioni autoimmunitarie

PATOGENICITA’ BATTERICA MECCANISMI di PATOGENICITA’ BATTERICA Bacteria-induced toxicity Host-mediated damage

PATOGENICITA’ BATTERICA MECCANISMI di PATOGENICITA’ BATTERICA

Meccanismi di patogenicità indiretti attraverso i meccanismi immuni adattativi

Immunità specifica ed immunopatologia Infezioni acute Infezioni croniche tuberculosi lebbra sifilide Persistenza di detriti batterici nei tessuti Autoimmunità

Malattie autoimmuni legate a mimicrismo antigenico

Tossine batteriche

Endotossine

Batteri Gram negativi: rilascio LPS

Struttura del Lipopolisaccaride Porzione Polisaccaridica: Antigen-O: antigenic properties, highly variable polysaccharide which is responsible for serologic diversity. Core: conserved polysaccharide, divided in two regions, outer-core and inner-core. Porzione lipidica: Lipid A: allows LPS insertion into the outermembrane and shows a similar structure among different species.

Endotossine: effetti Reazioni infiammatorie aspecifiche Stimolano rilascio di citochine Inducono attivazione del complemento Sono mitogeni / attivatori policlonali per i linfociti B Agiscono come adiuvanti Pirogeni

Shock settico Ipotensione (tissue pooling of fluids) coagulazione intravascolare disseminata febbre insufficiente ossigenazione tessutale generalizzata insufficienza di organi

Sistemi dell’ospite partecipano alla comparsa degli effetti tossici da endotossine LPS binding protein (LBP) CD14: LPS receptor on PMNs/M Receptor for other cell types? Signal transduction? C3H/HeJ mice lps gene is Toll-like receptor 4 MD2? Transcription factor: NF- LPS inducible proinflammatory factors: TNF, IL-1, IL-6/IL-8, NO, PAF, …

How does LPS signal cells? Macrophage: Endothelial cell: LBP LBP Soluble CD14 LBP LBP CD14

How does LPS signal cells? CD14 is a GPI-linked protein and cannot transmit a signal across the plasma membrane. CD14 must require a “co-receptor” capable of signaling.

How does LPS signal cells?

LPS signal transduction pathway MyD88-dependent pathway MyD88-independent pathway

1 IL-1 Macrophages LPS Bacteria +IFN +IL2 +IL3 - IL4 IL 1 TNF IL 6 Linphocytes LPS Macrophages +IFN +IL2 +IL3 - IL4 Endothelial cells IL 1 TNF IL 6 Endothelial cells Fibroblasts 1 PAF Proteases Free Radicals Eicosanoids PMN IL-1 ICAM, ELAM

Macrophages/Endothelial Effect of cytokines release LPS Macrophages/Endothelial cells direct response Primary mediators (IL1, IL6, TNFa) Endothelial/Leukocytes molecular activation Secondary mediators (NO, PAF, PG, LT, IL) Vasodilatation, capillary leak, endothelial damage, Reduced cardiac output, Respiratory failure,…

Effect of cytokines release

Genetic polymorphism and variability in host response Allelic variants Receptors: TLR4: D299G & T399I, 8% increased susceptibility to bacterial infection (decreased risk atherosclerosis); TLR5: 392Stop, susceptibility to legionnaires disease; CD14: -159 C>T reduced expression of mCD14; NOD2: several mutations associated to reduced response to LPS; Allelic variants Effector molecules: TNFa: 308 A>G, 3,7-fold increase in mortality by sepsis. IL1ra: two copies intron 2 associated to 2.1-fold increase in risk of severe sepsis.

Curr Opin Pulm Med, 2003

Endotoxins and Complement system

Endotoxins and Complement system

In sepsis the extrinsic coagulant pathway is activated (TFexposed on Homeostatsis of Coagulation cascade is lost in Sepsis In sepsis the anticoagulant and profibrinolytic mechanisms are down regulated with a resultant procoagulant state. In sepsis the extrinsic coagulant pathway is activated (TFexposed on damaged endothelial cells) > thrombin release >> fibrin deposition >>>

How to test for Endotoxins? Rabbit Pyrogen Test FD approved in 1941 Cell based assays In Vitro pyrogen assay LAL Test gel clot LAL approved in 1973 kinetic LAL in 1987

Rabbit Pyrogen Test Measure the change in temperature of 3 rabbits, after intravenous injection of the test solution.

Secretion of cytokines Cell based assays Whole blood assay Measure by ELISA the release of inflammatory cytokines (IL-1b, IL-6 and TNFa) in the culture supernatant of blood mononuclear cells exposed to test samples. LPS? Secretion of cytokines

LAL Limulus - genus of Horseshoe Crab Amoebocyte - blood cells Lysate - blood extract LAL is a FDA regulated biological that reacts chemically in the presence of gram negative cell debris. This reaction can be measured and quantified.

LAL Testing Gel Clot(Limit Test) Gel Clot(Semi-Quantitative) Endpoint Chromogenic Endpoint Turbidimetric Kinetic Chromogenic Kinetic Turbidimetric

Horseshoe Crab

Horseshoe Crab

LAL Assay LAL is > 100 times more sensitive, specific and accurate Economy of LAL permits more testing Tolerance of rabbits to endotoxin is a concern for FDA LAL activity correlates with pyrogenicity

Clotting Reaction For Activated LAL Endotoxin Pro-Clotting Enzymes Clotting Enzyme Substrate M++ pH=7.2 Coagulogen Coagulin Gel

Gel Clot LAL Plus Minus Lowest reagent cost Variability, subjectivity Simple reporting (+/-) Least sensitive Good stability Time consuming Simple technique Poor trending options

Sources of gel clot test problems Use of improper reaction or dilution tubes Incubating temperature too hot or too cold Improper dilutions Improper handling of lysate

Kinetic LAL Testing Endotoxin CLOT coagulogen coagulin CLOTTING CASCADE coagulogen coagulin proclotting enzyme clotting enzyme chromogenic substrate pNA

Kinetic LAL Advantages Quantitative results Higher throughput (96 wells) Lower sensitivity (to .001) Wider standard curve range Clear concise reporting Allows for data trending

Tossine batteriche

Domande Cosa si intende per microrganismo saprofita e parassita? Quali forme di rapporto si possono instaurare tra un parassita ed il suo ospite pluricellulare? Quali sono i vantaggi che fornisce la flora microbica saprofitica del tratto GI al suo ospite? Quali sono i fattori che influenzano l’evoluzione dell’incontro tra un microrganismo ed un ospite pluricellulare? Quali sono le principali vie di infezione? Quali sono i meccanismi di difesa aspecifici di cui è dotato un organismo pluricellulare per controllare la popolazione microbica presente su cute e mucose? Quali i meccanismi di difesa specifici di cui siamo dotati per neutralizzare i microrganismi? Cosa si intende per carica infettante? Cosa si intende per virulenza di un microrganismo e da cosa è determinata? Descrivere le varie fasi nello sviluppo di una infezione Adesione batterica: significato e strutture coinvolte Colonizzazione: significato e modalità di colonizzazione per i vari distretti corporei Biofilm: struttura, significato biologico ed importanza per processi infettivi

14. Meccanismi di disseminazione batterica 15. Meccanismi di escape dalla risposta immunitaria 16. Cosa si intende per Patogeni intracellulari e quali le strategie usate da questi batteri 17. Meccanismi di patogenicità batterica diretti ed indiretti 18. Endotossine batteriche: struttura, meccanismo d’azione ed effetti nell’ospite 19. Caratteristiche generali delle esotossine 20. Tipi principali di esotossine 21. Tossine con target extracellulare 22. Esotossine tipo I: tossine che agiscono sulla superficie cellulare 23. Esotossine che danneggiano la membrana cellulare 24. Cosa sono e quale è la struttura/meccanismo d’azione delle emolisine 25. Determinanti genetici delle esotossine batteriche con esempi 26. Esotossine con target intracellulare: descriverne il meccanismo d’azione 27. Esotossine con target intracelulare: descriverne la organizzazione molecolare 28. Esotossine con target intracellulare: descrivere tipo di attività enzimatica catalizzata 29. Esotossine batteriche: tossina colerica (struttura e meccanismo d’azione) 30. Esotossine batteriche: tossina antrace (struttura e meccanismo d’azione) 31. Esotossine batteriche: tossina difterica (struttura e meccanismo d’azione) 32. Esotossine batteriche: tossine botulinica e tetanica (struttura e meccanismo d’azione) 33. Tossine di tipo IV: inoculate nella cellula bersaglio 34. Applicazioni biotecnologiche tossine batteriche 35. Cosa sono le infezioni opportunistiche e quale la loro rilevanza