Sensibilità agli antibiotici in vitro e ricerca dei geni responsabili dell antibiotico- resistenza in ceppi di Salmonella isolati da alimenti, mangimi e animali Maria Rosaria Carullo, Anna Giannina Perugini, Giovannina Giuliano, Mario Bartoli, Vincenzo Caligiuri, Federico Capuano Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Via Salute, Portici (Napoli) Introduzione La diffusione della resistenza agli antibiotici negli ultimi anni è diventata un fenomeno di interesse sanitario mondiale. Tale resistenza ai farmaci, spesso dovuta a elementi genetici presenti nel DNA cromosomico, è gran parte delle volte mediata anche dal DNA extracromosomico (es. i plasmidi), pertanto risulta anche facilmente trasferibile. La possibile diffusione di ceppi con un sempre maggior numero di geni di resistenza ai farmaci potrebbe costituire uno dei principali problemi sanitari nel prossimo futuro, considerando anche il potenziale (e in alcuni casi, dimostrato) passaggio dei geni di resistenza dagli isolati di origine animale a quelli di origine umana. La Salmonella, in particolare, rappresenta ancora uno dei principali agenti patogeni di origine alimentare per luomo. Nel presente studio, ceppi di Salmonella isolati da alimenti, mangimi e animali sono stati analizzati sia per valutare la loro sensibilità in vitro agli antibiotici, sia per determinare la presenza di alcuni dei geni responsabili della resistenza alle molecole più usate in medicina veterinaria e umana ma anche per valutare la possibile differenza nel profilo di resistenza tra i ceppi di diversa origine. Bibliografia Enne V.I., Livermore D.M., Stephens P., Hall L.M.C., The Lancet, 357: ; Grape M., Sundstrom L., and Kronvall G., J. Antimicrob. Chem., 52: ; National Committee for Clinical Laboratory Standards, Approved standards M7-A5: methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. NCCLS, Wayne, Pa.; Perreten V. and Boerkin P., Antimicrob. Agents Chemother., 47(3): ; Yang S.J., Park K.Y., Kim S.H., No K.M., Besser T.E., Yoo H.S.,Kim S.H., Lee B.K., Park Y.H., Vet. Microbiol., 86: Risultati Degli 89 ceppi analizzati, 87 appartengono alla sottospecie Enterica e di questi il 35.6% risultano essere Typhimurium, il 5.75% Derby e, rispettivamente, il 4.6% London, Livingstone, Anatum, Enteritidis, Infantis. La percentuale di isolati resistenti ai differenti antibiotici testati è riportata nella tabella 1. Tra gli isolati è stato possibile rilevare la presenza di numerosi ceppi caratterizzati da resistenze multiple, infatti dei 19 isolati da organi 8 risultano resistenti ad almeno 6 delle molecole testate, dei 51 ceppi isolati da alimenti destinati al consumo umano, 20 ad almeno 6, e dei 6 ceppi isolati da mangimi 5 risultano resistenti a almeno due antimicrobici. Tutti gli isolati analizzati amplificano il target specifico per Salmonella spp.(sipB/C, 232 bp). Dei ceppi isolati da animali 8 risultano resistenti allampicillina e di questi 4 sono positivi per uno dei due geni di resistenza cercati (PSE-1 o TEM, 132 e 291 bp rispettivamente), mentre un solo ceppo li presenta entrambi. Tra tali ceppi, inoltre, 15 risultano resistenti ai sulfamidici, di cui 3 per sul1 e 4 per sul2. Tra i ceppi isolati da matrici alimentari, 17 sono resistenti in vitro allampicillina; di questi 2 risultano portatori di entrambi i geni di resistenza, 6 solo per PSE-1 e 13 solo per TEM. Dei ceppi suddetti, inoltre, 41 risultano resistenti ai sulfamidici, e tra questi oltre ad essere presenti dei positivi per sul1 (9) o sul2 (9), sono stati identificati anche tre ceppi positivi per il gene sul3. Tra gli isolati ben 13 mostrano resistenza multipla di tipo ACSSuT; di questi 12 appartengono al sierotipo typhimurium che causa, insieme al sierotipo enteritidis, il maggior numero di casi di salmonellosi nelluomo. Anche tra gli isolati ACSSuT, infine, è evidente la diffusione dei markers sul1 (11), sempre associato a cmlA/tetR (260 bp), PSE-1 (7) e TEM (3), questi ultimi presenti anche simultaneamente (3). Materiale e metodi Isolamento Gli 89 ceppi analizzati sono stati isolati da carni fresche e lavorate, mangimi (sfarinati e mangimi composti integrati) e da organi vari. Lidentificazione dei ceppi isolati è stata confermata mediante BBL Crystal (Becton, Dickinson, NJ, USA), quindi gli isolati sono stati sottoposti sia ad agglutinazione rapida su vetrino per gli antigeni somatici (O) sia ad agglutinazione lenta in provetta per gli antigeni flagellari (H) (Difco Co., USA). Sensibilità a gli antimicrobici La sensibilità agli antibiotici è stata valutata attraverso il metodo Kirby-Bauer su agar per: acido nalidixico, ampicillina, cefotaxime, ciprofloxacina, gentamicina, neomicina, colistina solfato, kanamicina, streptomicima, sulfamidici, cloramfenicolo, tetraciclina, sulfametoxazolo-trimetoprim, amoxicillina, enrofloxacina, cefalotina. Le zone di inibizione della crescita sono state misurate e interpretate in base ai criteri stabiliti dal National committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). PCR 3-5 colonie isolate su agar sono state risospese in 0.2 ml di acqua deionizzata DNAse-Rnase free (MP Biomedicals, Germany), quindi lisate mediante bollitura, infine centrifugate per 5 a rpm; il surnatante recuperato è stato sottoposto ad analisi spettrofotometrica a 260 e 280 nm. Quattro coppie di primers (Yang S.J. et al., 2002) sono state usate per lamplificazione di 4 geni target simultaneamente (mtPCR, mutiplex PCR), uno dei quali specifico per Salmonella spp., usando un GeneAmp PCR System 7700 (Applied Biosystems, USA) alle seguenti condizioni: dopo lattivazione della Taq di tipo Hotstart a 95° C per 10, sono stati eseguiti 40 cicli di amplificazione (95° C per 1, 48°C per 30, 72°C per 30), seguiti da una extention finale di 3 a 72°C. Sono state, poi, eseguite altre 3 PCR (simplex-PCR) per valutare la presenza dei geni responsabili della resistenza ai sulfamidici (Enne V et al.,2001; Perreten and Boerlin, 2003). Al termine delle PCR, gli amplificati della mtPCR e quelli delle simplex sono stati analizzati mediante elettroforesi rispettivamente su gel di agarosio al 3% e al 1% (w/v) preparati in TBE 1X (Invitrogen, USA). I prodotti di amplificazione sono stati visualizzati mediante colorazione con etidio bromuro mediante esposizione agli UV (foto 1, foto 2). I risultati delle analisi condotte sui ceppi isolati sono stati elaborati con il software SPSS12.0. Foto 1: elettroforesi (3%, agarosio/TBE 1X) per mPCR. Tutti gli isolati sono positivi per sipB/C (232 bp). 1,3,6: positivi per TEM(291 bp); 7,10,13: posotivi per cmlA/tetR (260 bp) e PSE-1 (132 bp). M: 25 bp DNA step ladder (Promega) 132 bp 232 bp 260 bp291 bp M Foto 2: elettroforesi (1%, agarosio/TBE 1X) della PCR per sul 1. 2, 5, 8: isolati positivi. N: 100 bp ladder (Fermentas); L: 50 bp DNA step ladder (Promega) N L N L Conclusioni Lanalisi condotta sui ceppi isolati evidenzia la diffusione di isolati di Salmonella che mostrano resistenze multiple, aventi pattern di geni di resistenza differenti. La mPCR usata in questo studio, in particolar modo, ha permesso di valutare rapidamente la distribuzione di due dei geni responsabili della resistenza agli antibiotici β-lattamici (TEM e PSE) in Salmonella. Lo studio dellevoluzione e della diffusione dei geni di resistenza, qui preliminarmente condotto, potrebbe aiutare a comprendere lorigine dei ceppi resistenti e la modalità di trasmissione dagli alimenti di origine animale alluomo. MOLECOLA TESTATA Numero (% ) di isolati resistenti in vitro ACIDO NALIDIXICO41 (46,1) AMPICILLINA30 (33,7) CEFOTAXIME1(1,1) CIPROFLOXACINA1 (1,1) GENTAMICINA48 (53,9) NEOMICINA86 (96,6) COLISTINA SOLFATO89 (100) KANAMICINA80 (89,9) STREPTOMICINA89 (100) SULFONAMIDE68 (76) CLORAMFENICOLO22 (24,7) TETRACICLINA68 (76,4) TRIMETOPRIM20(22,5) AMOXICILLINA19 (21,3) ENROFLOXACINA13 (14,6) CEFALOTINA62 (69,7) Tabella 1: isolati resistenti in vitro