Interattori molecolari nel controllo della tolleranza immune Dott. Fortunato Ferrara Tutore e Relatore: Dott. Alberto Tommasini

L’omeostasi del sistema immunitario Protezione dai microrganismi Tolleranza verso il SELF CD4+ CD25+ Cellule T regolatorie

Tolleranza centrale: Selezione positiva - Corteccia timica. Timociti immaturi. Riconoscimento della molecola MHC esposta dalle cellule dell’epitelio timico. Il non riconoscimento porta alla delezione. Selezione negativa Zona interna (midollare) del timo. È controllata da cellule presentanti l’antigene (APC). Timociti con alta affinità per gli antigeni self presentati dalle APC vengono eliminati. Tolleranza periferica - Svolta principalmente dalle cellule T regolatorie. - Controllano e sopprimono la reattività contro il self di linfociti T “sfuggiti” alla selezione timica.

Ruolo delle CD4+ Treg nelle situazioni di “normalità” o patologiche Cellule Teff autoreattive “sfuggite” alla selezione timica Cellule Teff contro i non-self CD4+CD25+ Treg - Self Foreign Patogeni Tumori Trapianti Teff Protezione dallo sviluppo di patologie autoimmuni Controllo dei processi immunitari

Dalla clinica alla ricerca di base Il caso di Lorenzo… -Risposta solo parziale a nutrizione parenterale totale (non allergia!) -Nei mesi successivi si verificano diversi episodi di polmonite interstiziale, di eziologia incerta, accompagnati da peggioramenti dell'eczema e della diarrea, -Biopsia intestinale: enteropatia autoimmune. -Nel 2° anno anemia emolitica, alopecia e DMT1

I P E X Disregolazione immunologica Poliendocrinopatia Enteropatia Trasmissione X-linked recessiva Mancato funzionamento cellule Treg Presente nei primi anni di vita: IDDM Severa enteropatia Disordine epidermici Fenomeni autoimmuni vari Autoanticorpi contro: Tiroide Rene Isole pancreatiche Intestino tenue Piastrine ed altro

FoxP3 nelle cellule Treg Foxp3 è un fattore trascrizionale – FKH family – specifico per le cellule Treg E’ il master regulator per lo sviluppo e la funzione delle cellule€ Treg Le mutazioni del gene Foxp3 portano alla comparsa dell’IPEX Ο = missense point mutations = deletion/frameshift mutations  = splicing mutations Come fattore trascrizionale: Regolatore/soppressore della produzione di citochine NFAT e NF-kappaB Blocca/regola la capacità di esprimere proteine chiave per la produzione di citochine ed altri fattori essenziali all’attivazione

Il ruolo “a valle” di FOXP3 Induzione alla trascrizione di alcuni geni Soppressione della trascrizione di altri geni

…“a monte” di FOXP3 Identificazione delle proteine che interagiscono con FOXP3, permettendo la localizzazione e funzione ? Patologie – IPEX like Foxp3 NFAT

Analisi degli interattori Interessante analizzare la cascata di eventi molecolari che portano alla attivazione di FOXP3 Analisi degli interattori

Obbiettivi: 1- Produzione di Foxp3 come proteina ricombinante 2- Valutazione di diverse metodiche biomolecolari per isolamento di potenziali nuovi interattori

1 - Produzione di Foxp3 in forma ricombinante FOXP3 + Mal Circa 90KDa mRNA cDNA Foxp3 PCR amplification Zn-fing N-term PBL cells FKH Produzione Riconoscimento proteina con Ab-specifico Purificazione

2.1 - Co-precipitazione Amilosio MBP Foxp3 Foxp3 MBP MBP MW 90 Kda

2.2 Immuno-precipitazione Foxp3 MBP Y Proteina G Foxp3 MBP Y

Phage display antibody libraries Lymphocytes scFv Helper phage gene III VH CH1 CH2 CH3 VL CL mRNA E. coli cDNA linker PCR Gene III scFv Phagemid vector Ori Transformation assembly PCR scFv cloning Amp

VL VH ELISA Foxp3 VL VH VL VH CH2 WB CH3 SV5 Minibody

Immunoprecipitazione Y Y Foxp3 MBP Y Y Y Foxp3 MBP Y Verifica della metodica Per interattori noti (NFAT/NfkB)

display di peptidi casuali 2.3 Costruzione di libreria di cDNA di cellule Treg scFv Gene III Vettore pPAO fagmidico Ori Cellule o tessuti cDNA frammentazione Amp display di peptidi casuali

Isolamento cloni più reattivi sequenziamento FP3 Analisi sequenze: - 25 cloni selezionati - 24 riconfermano uno stesso peptide - 1 peptide diverso

Analisi dell’interazione con i domini Zn FKH PRR FOXP3 Analisi dell’interazione con i domini FKH Zn PRR Il clone di “tipo 1” è specifico per l’interazione con il dominio Zinc-finger Il clone di “tipo 2” riconosce la proteina intera ma non uno dei singoli domini: eventuale effetto di mancata conformazione dei domini ricombinanti

La maggioranza dei cloni (24/25) codificano per una peptide di 100a.a. BLAST: Sequences producing significant alignments: Score E value solute carrier family 25, member 23 [Homo sapiens] 176 4e-43 putative calcium binding transporter [Homo sapiens] 175 7e-43 INTER PRO SCAN Q96NQ4_HUMAN_Q96NQ4 Efhand No description EF_HAND_2 EF_HAND_1 Calmodulin Calcineurin signaling proteins These proteins typically undergo a calcium - dependent conformational change which opens a target binding site.

Il restante clone: BLAST: INTER PRO SCAN Sequences producing significant alignments: Score E value matrix metalloproteinase-3 224 2e-57 INTER PRO SCAN MATRIXIN Peptidase_M10 No description MATRIX METALLOPROTEINASE STROMELYSIN They are zinc- dependent, calcium-activated proteases

Y Y FP3 AP interattore Clone selezionato (dominio EFH) prodotto in forma ricombinante

Analisi di omologia clone isolato con dominio EFH della calcineurina B b – NFAT c – Foxp3 Analisi di omologia clone isolato con dominio EFH della calcineurina B

AP Y Y FP3 AP Y interattore Y FP3 AP Calc B Y Y FP3 EFH calcB

Risultati Validato il sistema delle librerie anticorpali fagiche per la selezione e produzione di efficaci anticorpi ricombinanti contro Foxp3. Messa a punto di un protocollo di immunoprecipitazione per successive conferme di ulteriori interattori molecolari di Foxp3. Capacità di isolare mediante librerie peptidiche fagiche potenziali nuovi domini proteici interagenti con Foxp3. Verificata l’interazione tra Foxp3 ed una struttura calcio legante (EFH). C’è la possibilità che i peptidi selezionati non identificano reali proteine coinvolte nel network di attivazione di FOXP3, ma solo “motivi strutturali” coinvolti.

…sviluppi futuri e futuribili Confermare la potenziale interazione caratterizzata in una proteina “fisiologicamente significativa”. -Utilizzare gli anticorpi ricombinanti prodotti e caratterizzati in altri saggi sperimentali, anche con possibile sviluppo clinico-prognostico (immunoistochimica su tessuti tumorali o sedi di infiammazioni croniche). -Messa a punto di una librerie peptidica fagica maggiormente specifica per descrivere il complesso proteico caratteristico delle cellule Treg.