XXI Ciclo di dottorato Medicina materno infantile, pediatria dello sviluppo e delleducazione, perinatologia Ruolo del glutine nella risposta autoanticorpale.

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1 XXI Ciclo di dottorato Medicina materno infantile, pediatria dello sviluppo e delleducazione, perinatologia Ruolo del glutine nella risposta autoanticorpale mucosale: celiachia e cardiomiopatia dilatativa Dottoranda: Quaglia Sara

2 La cardiomiopatia dilatativa Lindicazione principale per il trapianto di cuore Eziologia 40% 20% 10% 30% Idiopatica Fattori genetici o famigliari Sostanze cardiotossiche Autoimmune

3 Celiachia e autoimmunità 5,1 10,5 16,7 27 34 0 10 20 30 40 <22-44-1212-20>20 Prevalence (%) of autoimmune disorders in coeliacs by age at diagnosis

4 Celiachia e cardiomiopatia Cardiomyopathy Associated With Celiac Disease Nisheeth K, Robert D. Patrik S. Mayo Clin Proc. 2005;80(5):674-676 Idiopathic dilated cardiomyopathy associated with coeliac disease: the effect of a gluten-free diet on cardiac performance M. Curione, M. Barbato, F. Viola, P. Francial, L. De Biase, S. Cucchiara DlGEST LIVER DIS 2002;34:866-69 Prevalence of coeliac disease in idiopathic dilated cardiomyopathy M Curione, M Barbato et.al Lancet 1999; 354:222-3

5 Costruzione librerie anticorpali totali da mucosa intestinale Due soggetti con cardiomiopatia dilatativa e celiachia BiopsiaRNAcDNA Amplificazioni VH, Vk, Vλ Paz 1Paz 2 ~400bp VKVHVλVλVKVHVλVλ

6 BsshII XhoI NheI linker VHVL Assemblaggio scFv Clonaggio Trasformazione Vettore fagmidico pDAN5 GeneIII VL VH bla DH5αF Titolo librerie 10 6

7 ~800bp Controllo colonie trasformate Cloni stabili e NON deleti

8 VH+VK Paz 1 VH+V λ Paz 1 VH+VK Paz 2 VH+V λ Paz 2 Finger Buona diversità

9 Libreria anticorpale DH5αF Fago helper Infezione Selezioni su antigeni

10 Table 1. Autoantigens of cardiac autoantibodies in patients with DCM Sarcolemmal proteins Myosin Actin Tropomyosin Troponin I Mitochondrial proteins Adenine nucleotide carrier Nicotinamide-adenine dinucleotide dehydrogenase Ubiquinol–cytochrome-c reductase Lipoamide dehydrogenase Pyruvate dehydrogenase Flavinylated protein Heat-shock proteins Hsp70 Hsp60 Hsc70 Membrane receptors b1-Adrenoceptor Muscarinic receptor Troponin I Okazaki et al. TRENDS in Molecular Medicine Auto-antigeni candidati: Cuore specifici (proteine del sarcolemma, miosina…) Proteine mitocondriali Heat shock proteins Recettori di membrana (recettore β 1 -adrenergico, recettore muscarinico…) Autoimmunità nella cardiomiopatia dilatativa

11 Libreria anticorpale DH5αF Fago helper Infezione Selezioni su antigeni Miosina Recettore adrenergico β1

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13 Purificazione DNA plasmidico Eco RIHind III Digestione e purificazione da gel di agarosio mRNA Retro- trascrizione cDNA ECII loop del β 1 -AR Purificazione Amplificazione Ligazione

14 Trasformazion e batterica 2h3h4hO/NNI 52 Kd

15 12 3 4 Purificazione proteica MBP- dominio IIEC Passaggio lisato cellulare Impaccamento della resina Eluizione del II dominio Dialisi Concentrazione Quantificazione proteica

16 Abbiamo deciso di comprarlo come peptide di sintesi Ci siamo rivolti a due ditte: La prima dopo mesi di tentativi ha rinunciato La seconda ha riscontrato problemi ma continua a provare PROBLEMI CON LA PRODUZIONE DEL RECETTORE Poco prodotto Non ben purificato Noi aspettiamo fiduciosi

17 Selezione su miosina Libreria Paz.1 Cloni positivi trovati 34/90 Libreria Paz.2 Cloni positivi trovati 30/90 Libreria Ctrl.- Cloni positivi trovati 7/90 Selezionate:Da selezionare Libreria di soggetto celiaco senza cardiomiopatia

18 Miosina muscolare di coniglio e miosina cardiaca porcina Prova di selezione di una libreria di paziente su miosina cardiaca porcina Risultato: 87 cloni positivi su 90 Problema laboratoristico? Iperamplificati o favoriti alcuni cloni? Lantigene non è pulito e crea problemi di legami aspecifici? Riflessioni Omologia con la miosina umana: Miosina muscolare di coniglio vs miosina muscolare umana : omologia 95% MIosina muscolare di coniglio vs miosina cardiaca umana : omologia 81% Miosina cardiaca porcina vs miosina cardiaca umana omologia 95%

19 Selezione su antigeni di controllo Abbiamo deciso di provare a selezionare la libreria dei nostri pazienti su antigeni di controllo positivi e negativi. Antigene controllo positivo tTg Antigene controllo negativo BSA Selezione su tTg Libreria paz 1 39/90 Libreria paz 2 37/90 Selezione su BSA Libreria paz 2 0/90

20 Ruolo del glutine nella risposta mucosale Uno dei due pazienti si è sottoposto ad una II biopsia dopo un anno di dieta senza glutine Costruzione della libreria totale IgA Selezione di questa sugli antigeni già utilizzati