La regolazione secondo… Biochimica classica o MCA? Rohwer and Hofmeyr (2010) Kinetic and Thermodynamic Aspects of Enzyme Control and Regulation. J. Phys. Chem. B, 114:16280–16289.

Regulation of Glycolysis Come descriviamo la regolazione (della velocità) dei singoli enzimi e dei flussi? Basta sapere i ΔG/ΔG°'? What is the contribution of thermodynamics to the rate of a chemical reaction, whether catalyzed or uncatalyzed?  Distinguishing between near-equilibrium and far-from-equilibrium reactions http://web.campbell.edu/faculty/nemecz/323_lect/glycolysis/images/regulation1.jpg http://web.campbell.edu/faculty/nemecz/323_lect/glycolysis/images/regulation1.jpg

(ovverosia la cinetica) atto III (ovverosia la cinetica) Facciamo un passo avanti richiamando alcune nozioni di cinetica A B ← → vf vr vf = Kf [A] vr = Kr [B] All’equilibrio vf = vr e quindi Kf [A] = Kr [B] e cioè Kf / Kr = ([B] / [A]) = Keq Se non siamo all’equilibrio, allora vf ≠ vr . Quanto differiscono? Quanto vale vr / vf ? Vf= velovità istantanea, NON velocità max forward (correggi anno prox)!!!

Vale la disequilibrium ratio! Q o Γ Keq Se questa reazione fuori dall’equilibrio è immersa in una via (pathway) il cui flusso è v (velocità netta), allora: A B ← → vf vr v

In una via allo ss, J = v = vf - vr o anche vf = vr + v , per cui: Se la reazione è vicina all’equilibrio (ρ  1), allora: v << vf vr Se la reazione è lontana dall’equilibrio (ρ  0), allora: v  vf e vr  0 Generalizzando la reazione:

To assess the contributions of kinetics and thermodynamics to reaction rate one could plot v against a in linear rate and concentration space Il contributo dei due termini è difficile da interpretare perché i termini si moltiplicano

The rate is mainly determined by the forward rate (i.e., by kinetics) Ma usando ln(v) The thermodynamic function dominates =0.1 =0.9 When >0.9, then v is mainly determined by the distance from equilibrium. Net rate of the chemical reaction as a function of the concentration of A

Quando la reazione è vicina all’equilibrio (ρ  1), allora: v << vf vr Se una reazione è già vicina all’equilibrio, e noi aggiungiamo enzima, la reazione si avvicinerà ancora un poco all’eq., ma non ci sarà un grande aumento di P per cui non ci sarà propagazione del segnale, al contrario di reazioni lontane dell’eq. Questo tipo di ragionamenti hanno convinto i biochimici di 50 anni fa che le reazioni vicine all’equilibrio sono catalizzate da enzimi presenti in eccesso e quindi questi enzimi non potranno essere limitanti per il flusso. Al contrario, in una reazione lontana dall’equilibrio catalizzata da un enzima, la velocità della catalisi è poco più grande del flusso, per cui è potenzialmente limitante.

Alla ricerca del Rate Limiting Step (RLS) Tutti i ragionamenti sopra descritti hanno portato a postulare che in una via metabolica, “quando un processo è dipendente, per quanto riguarda la sua velocità, da numerosi fattori separati, la velocità dell’intero processo sarà determinata dal più lento dei fattori” (Blackman, 1905)* (vedi anche Voet e Voet, p350) Questo è verificato sperimentalmente nelle reazioni ed es. di decadimento, o anche in reazioni chimiche a molti stadi *When a process is conditioned as to its rapidity by a number of separate factors, the rate of the process is limited by the pace of the slowest factor. Blackman (1905). Cosa vuole dire in realtà “dal più lento dei suoi fattori” se in una via metabolica tutte le reazioni vanno alla stessa velocità (che corrisponde al flusso J della via)?

Il RLS del flusso autostradale (ma descrive il metabolismo?) Fuorviante per due motivi: v dipende da S e da P (e può anche tornare indietro!) Il RLS del flusso autostradale (ma descrive il metabolismo?)

Il Rate Limiting Step significa: Che la velocità di una via possa essere variata solamente cambiando l’attività di un particolare enzima.

Da Lehninger 5. Regulatory Enzyme In metabolic pathway, there is at least one enzyme that set the rate of overall sequence ……… Regulatory Enzyme Example : Glycolysis pathway → Hexokinase, Pyruvate kinase ect. There are two major classes of regulatory enzymes in metabolic pathway. (1) Allosteric enzyme : function through reversible, noncovalent binding of regulatory compounds → allosteric modulator Allosteric modulator → small metabolites, cofactor….. activator (positive), inhibitor (negative) (2) Other enzyme : reversible covalent modification Da Lehninger

…ma come identificarlo? Per questo lo studio del controllo del metabolismo coincideva essenzialmente con l’identificare i RLS. Si è cercato prima di identificare gli enzimi potenzialmente regolatori e poi, tra questi, quello che fosse “il” RLS. Un enzima potenzialmente regolatore è stato definito come: * quello che catalizza una reazione lontana dall’equilibrio * la cui attività è controllata da fattori diversi dai substrati * l’enzima che risponde al primo segnale metabolico e che provoca i successivi cambiamenti nell’attività dei restanti enzimi

ρ Nella glicolisi quali sono gli enzimi più lontani dall’equilibrio? Pho Pgl Trn Hek Gpi Pfk Pgm Eno Pyk 1 10-1 10-2 Nella glicolisi quali sono gli enzimi più lontani dall’equilibrio? 10-3 ρ 10-4 10-5 10-6 10-7 Displacement of reaction in perfused Rat heart

Nella glicolisi nel cuore di ratto presenta almeno quattro reazioni con un ρ più piccolo di 0.1 (valore indicativo) per cui non si può decidere quale sia il RLS Proviamo a cercare un altro indicatore valido per identificare il RLS. Storicamente ne sono stati proposti diversi, come ad esempio il valore del rapporto tra massima attività catalitica e flusso nella via (VM / J); quanto più il rapporto è tendente a 1 tanto più l’enzima sarà limitante

Nella glicolisi quali sono gli enzimi con maggiore VM ? Nella glicolisi la Vmax di molti enzimi sembra in largo eccesso rispetto al flusso Nella glicolisi quali sono gli enzimi con maggiore VM ? 103 102 10 Pho Pgl Hek Gpi Pfk Ald Tim Gad Pgk Pgm Eno Pyk Lad 1 Relative enzyme activities in perfused Rat heart

Anche qui non possiamo definire con certezza quale sia il RLS Questi metodi non arrivano a conclusioni univoche, per cui si ricorreva spesso a conferme con criteri diversi (cross-over, misure di flussi con isotopi, presenza di regolatori allosterici, mutanti metabolici, aggiunta di intermedi…) La presenza di un RLS (anche detto Rate Determining Step) cosa comporta? il flusso a questo step vari in risposta alla richiesta metabolica la variazione di flusso sia trasmessa lungo la via Vedi il cap4 del Fell per dettagli sui vari metodi Vedi trattazione sulla propagazione della variazione (V&V, p.470)

In una via allo ss, J = vf - vr Come si propaga la variazione di flusso a partire da un RLS? (secondo Voet & Voet) In una via allo ss, J = vf - vr Se esistesse un RLS, questo comporterebbe: che l’enzima sia il primo a cambiare attività (flusso) e che la variazione di flusso sia trasmessa lungo la via attraverso un aumento del prodotto Se il prodotto A passa da [A] ad ([A] + Δ[A]), il flusso varia Come esprimiamo vf? ΔJ = Δvf

Se [A]<< KM allora: that is, the fractional change in reaction rate is equal to the fractional change in sustrate conv. Se [A]<< KM allora:

C’è contraddizione tra le due espressioni: come posso descrivere una reazione reversibile con una MM irreversibile??? Inoltre l’assunzione per cui [A]<< KM rischia di essere irreale … spesso le [Si] sono ~KM (se non maggiori) <

THIS IS ALL CRAP! Gli enzimi sono reversibili Le vie metaboliche hanno variazioni incredibili di flusso con piccole variazioni di concentrazione degli intermedi: nella glicolisi si verifica un aumento di flusso di 100-1000 volte ma la concentrazione degli intermedi aumenta di circa 10 volte. Non si può fare di necessità virtù nel caso degli enzimi*. Abbiamo bisogno di un modo di ragionare diverso e soprattutto quantitativo. * Non si può usare il ΔG come indice di RLS, perché questa è una necessità dovuta al fatto che già il ΔG°’ è grande. Reazioni con un grande ΔG devono essere controllate… Tutti gli enzimi (vicini o lontani dall’equilibrio) influenzano il flusso (con meccanismi diversi)

The law of the flush (1) (legge dello sciacquone) F6P + ATP  F1,6BP + ADP ΔG= -22 KJ/mol Reazioni lontane dall’eq. Flux (l/s) = πr4Δp/8ηΔx A B Δh hA hB (Δp/Δx)= driving force Δp=kΔh r: raggio del tubo Δp: differenza di pressione η: viscosità del liquido Δx: lunghezza del tubo πr48η = Flux carrying capacity In metabolic terms ΔG is the driving force and Vmax the flux carrying capacity (amount of enzyme). When ΔG is large Vmax can be small.

The law of the flush (2) Flux (l/s) = πr4Δp/8ηΔx Reazioni vicine all’eq. G6P  F6P ΔG= -1.4 KJ/mol Flux (l/s) = πr4Δp/8ηΔx When the driving force ΔG is small, Vmax (amount of enzyme) must be high

v Reazioni con ΔG ~0 Che relazione tra v e Vmax? S P=0 P=1 P=3 P=5 Velocità di un enzima MM reversibile in presenza di quantità crescenti di Prodotto Mantenendo S costante e vicino al valore di equilibrio, la velocità, in presenza di quantità crescenti di P, crolla P = 0, v = 4.56 P = 1, v = 3.35 P = 3, v = 1.45 P = 5, v = 0.031 Vmax=5 KS = 0.5 Keq = 1 KP = 1

(VP=0/VP=5) = 150 ≈ Vmax/Vin vivo S =5.05 v an enzyme ‘close to equilibrium’ has to be in large excess to keep the reaction close to equilibium P=3 P=5 S =5.05 (VP=0/VP=5) = 150 ≈ Vmax/Vin vivo

È una reazione con ΔG°′ <<0 Un enzima con Keq molto grande sente molto meno questo problema (a meno che P non sia più grande di S di vari ordini di grandezza ) P=0 P=1 P=3 S =5.05, P = 0, V = 4.55 S =5.05, P = 1, V = 4.17 S =5.05, P = 3, V = 3.57 S =5.05, P = 5, V = 3.13 P=5 Vmax=5 KS = 0.5 Keq = 1000 KP = 1 È una reazione con ΔG°′ <<0 S =5.05

Combinando reazioni vicine o lontane rispetto all’equilibrio A systemic view Per le reazioni vicine all’equilibrio, il flusso si si riduce quanto più ci si avvicina all’equilibrio. Un flusso dignitoso richiede un tubo grosso, perchè la driving force è piccola. Per le reazioni che sono lontane dall’equilibrio occorre avere dei limitatori del flusso, altrimenti il serbatoio a monte si svuota e quello a valle si riempie

La relazione tra ΔG e ΔG°' Athel Cornish-Bowden (1997) Harden and Young’s Discovery of Fructose 1,6-Bisphosphate, pp. 135-148 in New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge (ed. A. Cornish-Bowden), Universitat de València, Valencia, Spain. articolo disponibile a: http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/harden.htm Non sempre le reazioni con un ΔG°' grande presentano poi anche un ΔG grande. Qui si spiega il perché… Su questi aspetti: Morandini (2009) Plant Science 176:441-451.

Table 1. Thermodynamic characteristics of the early reactions of fermentation

What happens at a physiologically realistic concentration (around 50 μM) for both [G3P] and [DHAP]?  the concentration of fructose 1,6-bisphosphate at equilibrium will be 37 μM The use of ΔG0′ referred to above to predict which direction of reaction is favoured is worse than naive; it is wrong! putting all three concentrations to 50 μM, we get:  una reazione può procedere in vivo in direzione opposta a quanto indicato dal ΔG0′. Ciò che conta è ΔG !

Due corollari importanti Le reazioni con un ΔG°'<<0 sono spesso obbligate in vivo ad avere un ΔG<<0 * Le reazioni che con un ΔG°'~0 sono spesso obbligate ad avere in vivo un ΔG~0 * Quello che conta comunque è il ΔG (ρ)  Le reazioni con ΔG<<0 devono essere regolate  Le reazioni con ΔG ~0 si regolano “da sole” Gli enzimi non possono fare di necessità [regolazione] virtù [capacità di controllo] * Rischia di essere una semplificazione grossolana se non si considerano fattori come il n. di reagenti e substrati, la loro conc., il coinvolgimento di specie chimiche a conc. costante come H2O...)

“From a physiological point of view the most surprising result was that the heavily regulated allosteric enzyme, glycogen synthase, does not control flux but is needed to maintain homeostasis during flux changes. This novel role for a phosphorylated allosteric enzyme is proposed to be a general phenomenon in metabolic and signaling pathways, which physiologically link different cellular activities.” Shulman and Rothman (2001) 13C NMR of intermediary metabolism: implications for systemic physiology. Annual Review of Physiology. 63:15-48.

Effetto dell’enzima: Come l’enzima regola? Saturation term Rate constant Saturation term Mass action term enzymes bring two additional properties into the mix, i.e., binding and catalysis

...usando il passaggio a ln(v) Fig. from Rohwer & Hofmeyr (2010) ...usando il passaggio a ln(v)

Fig. from Rohwer & Hofmeyr (2010)

The uni-uni reaction equation Decomposition according to Rohwer & Hofmeyr (Stellenbosch) where (vcap)= k2 Et /Ks can be recast in a slightly different form: This term was inglobated with Vf in the previous formulation, but was moved here Decomposition according to P. Morandini (UniMi) where (Vf)= k2 Et

v approaches Vf at increasing s La decomposizione evidenzia meglio il limite di Vf v 10-1 100 103 102 10-2 10-3 101 s -6 -4 -2 2 4 6 ln v Vf vma Σ vcap (no enzyme) v approaches Vf at increasing s

All’aumentare della driving force l’ultimo termine diventa S, che, combinato con il secondo termine diventa uguale a 1.  rimane solo Vf Se 0 Se 0  S 0 significa che P<<Kp e S>>Ks

Decomposition according to R. Milo (Weizmann ist.) Se 0 Se 1 0 significa che P<<Kp e S>>Ks

Vf v v vthe vcap (no enzyme) s ln v Bin Anche questa decomposizione evidenzia il limite di Vf 103 6 Vf 102 4 v 101 2 v vthe ln v 100 -2 10-1 Bin -4 10-2 vcap (no enzyme) -6 10-3 -8 10-1 100 101 102 s

Referenze Per la parte di cinetica chimica vedere: * Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 1.4.2 e 1.4.3 Per il concetto di RLS, vedi * Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 4 Per la relazione tra ΔG°’ e ΔG°’ per le reazioni biochimiche, vedere: Athel Cornish-Bowden (1997) Harden and Young’s Discovery of Fructose 1,6-Bisphosphate, pp. 135-148 in New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge (ed. A. Cornish-Bowden), Universitat de València, Valencia, Spain. Articolo disponibile a: http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/harden.htm