Di che cosa abbiamo bisogno? PRINCIPI DI BASE Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B0 Un trasmettitore di radiofrequenza

PRINCIPI DI BASE Parole Chiave Esperimenti in Onda continua ed in Trasformata di Fourier

Thank you, Mr. Fourier! F(n) F(t)

FOURIER TRANSFORMATIONS F(n)=d(n0) F(n)=At(sinpvt)/pvt centered at n0 F(t)=exp(-t/T2) F(n)=T2/1+(2pnT2)2 -i 2pn(T2)2/1+(2pnT2)20 F(t)=exp(-t/T2)exp(i2pnA) F(n)=T2/1+(2p(n-nA)T2)2 -i 2p (n-nA)(T2)2/1+(2p (n-nA) nT2)20 FOURIER TRANSFORMATIONS

The FT allows to determine the frequency content of a squared function Why bother with FT? FT allows to decompose a function in a sum of sinusoidal function (deconvolution). In NMR FT allows to switch from the time domain, i.e. the signal emitted by the sample as a consequence of the radiofrequency irradiation and detected by the receiving coil to the frequency domain (NMR spectrum) The FT allows to determine the frequency content of a squared function

Aspetti delle Trasformate di Fourier importanti per NMR Una radiazione elettromagnetica v applicata per un tempo corto ha la proprietà di eccitare non solo la frequenza v ma anche tutte le frequenze intorno Tanto piu’ l’impulso è corto e tanto più è largo il range di frequenze eccitate Una somma di onde, puo’ essere decomposta nelle singole onde che l’hanno generata e puo’ essere convertita in una serie di frequenze La Trasformata di Fourier del prodotto di due funzioni è uguale al prodotto delle trasformate delle due funzioni

A “real” F.I.D.

The NMR Experiment z y x M B1 90° t wI I t To have a spin transition, a magnetic field B1 , oscillating in the range of radiofrequencies and perpendicular to z, is applied (perturbing pulse) The B1 field creates coherence among the spins (they all have the same phase) and net magnetization in the x,y plane is created After the pulse is switched off, the magnetization precesses in the xy plane and relaxes to equilibrium z y x M B1 90° t wI I t The current induced in a coil by the magnetization precessing in the xy plane is recorded. It is called FID.

FT relax. Preparation Detection x y z t2 w0

Signal to noise Scans S/N 1 1.00 80 8.94 8 2.83 800 28.28 16 4.00

Sensibilità dell’Esperimento NMR S/N  N g5/2 B03/2 N = Numero di spins che contribuiscono al segnale g rapporto giromagnetico del nuclide studiato B Camp magnetico utlizizzato

Ubiquitin 76 amino acids, 8,5 kDa

1D experiment ..Too crowded.. Chemical shifts relaxation rates Could be nice but... Not enough to get a structure What do we learn?

Occorrono informazioni strutturali, e correlazioni tra i vari spin che permettano l’assegnamento. Per ottenere cio’ é necessario osservare tutti i possibili accoppiamenti scalari e dipolari.

NMR MULTIDIMENSIONALE Gli spettri NMR monodimensionali permettono questo solo per molecole semplici e di basso peso molecolare. All’aumentare del PM, diventa impossibile individuare tutti gli accoppiamenti scalari dall’analisi dei multipletti e tutti gli accoppiamenti dipolari dagli esperimenti NOE monodimensinoali. NMR MULTIDIMENSIONALE

The need for multidimensional NMR

COSA SIGNIFICA Spettro NMR BIDIMENSIONALE

Cosa è un esperimento bidimensionale ? Dopo un impulso a 90° il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta, Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazione

Aq F2 Aq F1 wA (F1) wA (F2) wA (F1) HA HA wA (F1) wB (F2) HB PREPARAZIONE-ACQUISIZIONE t1- PERTURBAZIONE- ACQUISIZIONE (t2) 90° Aq F2 Aq F1 wA (F1) wA (F2) wA (F1) HA HA wA (F1) wB (F2) HB

Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari Perché la magnetizzazione di uno spin dovrebbe trasferirsi su quella di un altro spin? Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari

Eccito (impulso a 90°)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo, Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà l’informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M (wI t1) (wSt2)

EXAMPLE O H H N C C We make a 1H experiment and we acquire. I observe Hn Then all signals transfer the information because of scalar coupling H H N C Spectrum before The J coupling Then I observe Hc I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling

EXAMPLE O H H N C C Signal! 9 ppm 4 ppm H H N C Spectrum before This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Spectrum after The J coupling

EXAMPLE O H H N C C Signal! 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling H H N C This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

EXAMPLE O H H N C C If you begin from Hc , the situation is the same ! Spectrum before The J coupling Hc Hc Hn J-coupling Spectrum after The J coupling

EXAMPLE O H H N C C Therefore, if I consider only this system Hc Hc Hn Spectrum before The J coupling Hn J-coupling Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

The second dimension = t2 The first dimension = t1 The second dimension = t2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

Usually t1 is also defined as indirect dimension t2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies Definitions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions F1 Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions F2 CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

Accoppiamento scalare L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

COrrelation SpectroscopY Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ H4-H5 COSY= COrrelation SpectroscopY

COrrelation SpectroscopY Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ 2 4 3 H4-H5 5 6 COSY= COrrelation SpectroscopY 1

Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING

Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Aumenta la intensità di B Perturbo A

Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo Pensate a degli esempi, per favore

Through space AND throuhg bonds Through bond

Quando lo spettro è troppo affollato di segnali, non è possibile fare esperimenti monodimensionali, perché non tutti i segnali sono disttinguibili dagli altri E’ quindi necessario u nesperimento bidimensionale, ovvero un esperimento che permette di trasferire la magnetizzazinoe da uno spin all’altro utilizzando l’accoppiamento dipolare

Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY Example: Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NOESY NOE Effect: If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetization AA AB

Example: The real case: Some 1500 peaks are observed for a protein of 75 aminoacids NOESY experiment Cross peaks: A and B are close Diagonal peak AA AB

2D NOESY Spectrum

Distance constraints mJ B0 mI q r NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling mJ B0 mI q r

The “old times” approach NOESY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) COSY NOESY conn. COSY conn

La Spettroscopia NMR che utilizza sono spin 1H è solo un caso particolare della spettroscopia NMR bidimensinoale In effetti, accoppiamenti scalari e dipolari sono possibili anche tra spin diversi, es 1H e 13C 1H e 15N 13C e 15N 13C e 13C

In particolare, gli esperimenti che utilizzano accoppiamenti scalari tra spin diversi permettono di usare le 1J che di solito hanno valori maggiori e quindi danno esperimenti piu’ sensibili. Sarà pertanto possibile effettuare esperimenti bidimensionali dove in ciascuna delle due dimensioni si acquisicono nuclei diversi, per esempio 13C e 1H Otterremo un segnale nello spettro SE E SOLO SE abbiamo nel nostro sistema due spin (1H e 13C) che sono tra di loro accoppiati.

Questi esperimenti offrono molti vantaggi e aprono molte possibilità: Spin 1H e 13C potranno essere direttamente accoppiati tra di loro aiutando la identificazione dei varigruppi e semplificando l’assegnamento 2. Ogni picco permette di individuare due spin, semplificando il problema della identificazione dei segnali Un esperimento bidimensionale offre una risoluzione molto maggiore perchéi segnali non sono separati solo in una dimensionale ma in una matrice bidimensionale, permettendo cosi’ l’analisi di sistemi anche piu’ complessi e non risolvibili in 1D

1J couplings for backbone resonances

1J couplings for backbone resonances

The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment

The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment

E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C) ’ possibile, combinare questa possibilità con ciò che sappiamo a proposito degli accoppiamenti scalari e quindi UTILIZZARE gli accoppiamenti scalari per trasferire la magnetizzazione dauno spin 1H ad uno spin 13C ad esso scalarmente accoppiato

E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C) Inoltre possiamo combinare tutto cio’ con quello che sappiamo sugli esperimenti bidimensionali

2D HETCOR Expriment Eccito (impulso a 90°) 1H Acquisisco (t1) 1H – Perturbo (Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC Acquisisco (t2) 13C

2D HETCOR Expriment

2D HETCOR Expriment Prima dimensione

2D HETCOR Expriment Prima dimensione

2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione

2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione

Esempio COSY

Esempio COSY N.B. In questo caso non si osserva solo l’accoppiamento 3J ma si osserva una “propagazione” dell’informazione attraverso gli accoppiamenti scalari

Esempio HETCOR 4 3 1 5 2

2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence

2D HSQC Expriment Heteronuclear Single Quantum coherence

2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence Seconda dimensione Prima dimensione

2D HSQC Expriment Heteronuclear Single Quantum coherence Prima dimensione

2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence Seconda dimensione Prima dimensione

2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence E’ possibile progettare esperimenti per trasferire la magnetizzazione da un nucleo all’altro anche indipendentemente dall’acquisizione Seconda dimensione Prima dimensione In questo esperimento il primo spin che viene eccitato è 1H, la magnetizzazione viene trasferita da 1H a 13C PRIMA della acquisizione della prima dimensione, che quindi è 13C. SOLO i 13C che sono accoppiati ad 1H possono essere osservati! Successivamente la magnetizzazione e di nuovo trasferita 1H utilizzando sempre l’accoppiamento scalare ed alla fine osservo 1H

2D HSQC Experiment Eccito (impulso a 90°) 1H Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC Acquisisco (t1) 13C – Perturbo -Trasferisco la magnetizzazione da 13C a 1H utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC Acquisisco (t2) 1H

2D HSQC Experiment Questo tipo di esperimento si chiama anche Out and back Significa che parto da 1H, trasferisco da 1H a 13C (out), acquisisco 13C nella prima dimensione e poi torno (back) sullo stesso nucleo da cui sono partito Il doppio trasferimento fa si che l’esperimento sia molto piu’ selettivo Osservo solo 1H e 13C che sono accoppiati tra di se per effetto di 1J

The HSQC experiment

Caratteristiche dell’esperimento HSQC Non esiste la diagonale La magnetizzazione viene trasferita da 1H al 13C ad esso accoppiato Successivamente si acquisisce, nella dimensione indiretta, 13C Infine si ri-trasferisce su 1H e si osserva 1H Tutti gli 1H che non sono accoppiati a 13C NON si osservano

Heteronuclear NMR Transfer the information to all 1H coupled OBSERVE 13C during t1 Transfer the information to all 1H coupled OBSERVE 1H during t2 13C No more diagonal Each peak indicate A different H-C pair 1H

Heteronuclear NMR OBSERVE 13C during t1 Transfer the information to all 1H coupled Observe 1H during t2 No more diagonal CH2 Two protons are bound to the same carbon 13C 1H

The HSQC experiment

Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings

The 1H- 15N HSQC experiment Heteronuclear Single Quantum Coherence

The HSQC experiment Detect H-N couplings Each amide NH group gives rise to one peak Same sensitivity of a 1H experiment (although you are observing 15N) but much larger resolution In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak if you can do the job (whatever is your job)

Heteronuclear NMR in proteins example: 15N labelled proteins

Heteronuclear NMR in proteins example: 15N labelled proteins

The HSQC experiment Detect H-N couplings Each amide NH group gives rise to one peak Same sensitivity of a 1H experiment (although you are observing 15N) but much larger resolution In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak

The role of metal cofactor in protein unfolding Metal triggered protein folding Apo Cb @ 3.3 M GdmCl Ca2Cb @ 3.3 M GdmCl Ca2+ Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding

Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ion 95 77 60 20 59 HNd 28 35 15 6 26 45 96 7 90 HNe 32 75 72 94 33 37 13 12 8 3 78 65 28 34 100 88 23 41 36 46 83 64 27 80 89 48 62 99 14 84 21 17 43 24 25 74 29 86 30 79 47 51 58 16 42 87 22 4 11 98 39 10 76 69 97 53 91 81 93 56 101 40 67 57 19 38 71 52 55 68 54 85 66 82 5 HNe1 83 102 15H

The need for multidimensional NMR

Troppi segnali 1H ?

Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H 15N Only A more effective fingerprint -characterization -folding -dynamics protein size >10000 Homonuclear 2D experiments do not have enough resolution HSQC or HMQC HSQC-NOESY or HSQC TOCSY

Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H protein size >20000 15N and 13C Scalar couplings through 13C atoms -triple resonance -assignment -structure