Riparazione del danno da radiazione al DNA Esame di Radiobiologia Scuola di Specializzazione in Fisica Sanitaria A.A. 2003-2004 Antonella Roggio

Mutazione = Danno - Riparazione Le mutazioni del DNA possono essere il risultato di danno al DNA non riparato o mal riparato Mutazione = Danno - Riparazione La riparazione del DNA danneggiato ha una funzione centrale non solo nella protezione del genoma ma anche nella generazione della diversità genetica.* * Nilsen- Krokan “Base excision repair in a network of defence and tolerance” Carcinogenesis, Vol. 22, No. 7, 987-998, July 2001 Cause di mutazioni Errori naturali endogeni al DNA Danni esogeni al DNA (agenti fisici o chimici) Riparazione del DNA tendente all’errore

È più radiosensibile il nucleo o il citoplasma? Perché proprio il DNA? È più radiosensibile il nucleo o il citoplasma? È possibile provocare la morte cellulare irraggiando solo l’uno o l’altro? Il nucleo è 100 volte più radiosensibile del citoplasma per quanto concerne l’effetto letale Solo quando la dose al citoplasma è molto elevata si può verificare la morte della cellula È possibile uccidere le cellule e provocare altri tipi di danno irradiando il citoplasma ma è più semplice ottenere lo stesso effetto con l’irradiazione del nucleo

Come è “fatto” il DNA NUCLEOTIDE

Danno al DNA Evento fisico: Radiazioni x, γ, UV o particelle cariche di alta energia ionizzano la materia biologica cedendo energia  [Dose = ΔE/Δm]. Evento radiochimico: Formazione di radicali liberi Evento biologico: Danno a carico di molecole biologicamente importanti come acidi nucleici, membrane, etc.

Principali Tipi di Danno al DNA Ionizing Radiation Danno alle basi Danno ai nucleotidi SSB DSB Ponti di collegamento

Morte 2/3 di una popolazione cellulare (mammifero) Una dose di 1 ÷ 2 Gy Morte 2/3 di una popolazione cellulare (mammifero) Tutte le cellule hanno subito elevato numero di distruzione di basi 1000 SSB 50 DSB Le rimanenti cellule hanno riparato un elevato numero di lesioni o sono in grado di sopravvivere con un genoma lesionato

e Distribuzione del Danno nel DNA LET e Distribuzione del Danno nel DNA Il tipo e la distribuzione spaziale delle lesioni dipende dalla qualità della radiazione. Le tracce della radiazione sono uniformemente distribuite entro il nucleo Distruzione di basi, nucleotidi, SSB Basso LET Le tracce della radiazione sono “raggruppate” entro il nucleo DSB Alto LET

È un processo di difesa nei confronti di un danno Cos è la riparazione ? È un processo di difesa nei confronti di un danno È presente in tutti gli organismi studiati: batteri, lieviti, drosophila, pesci, anfibi, roditori e uomini.

Modi o tipi di riparazione Riparazione esente da errore Riparazione tendente all’errore Mancata Riparazione Può provocare mutazioni non letali o letali Non causa letalità o mutazioni La mancata riparazione è letale La cellula sopravvive Insorgenza di neoplasie Morte cellulare

Danno alle basi Lesioni a carico della Timina Correlazione lineare con la dose Insorge attraverso l’interazione con radicali liberi acquosi come l’OH• Nelle cellule di mammifero è più frequente delle SSB (rotture di catena singola). Lesioni a carico della Timina Incapacità nella riparazione alcuni tipi di danno alle basi atassia-telangiectasia (AT)

Base excision repair - BER Riparazione mediante asportazione Short Patch Repair Rimuove la singola base danneggiata Long Patch Repair Rimuove 2 ÷ 10 nucleotidi Damaged Base Abasic Site DNA Polymerase b XRCC1 DNA Ligase III DNA Glycoslyase AP endonuclease DNA Pol d/e PCNA FEN1 DNA Ligase I Short Patch Repair Long Patch Repair

Nucleotide Excision Repair (NER) nell’uomo Una nucleasi di escissione si lega al DNA nei pressi della lesione e taglia il filamento in entrambi i punti ai lati della lesione. Il frammento viene rimosso dalla DNA-elicasi Il segmento mancante viene colmato dalla DNA-polimerasi Infine viene unito al DNA dalla DNA-ligasi

Single Strand Break — SSB Riparazione mediante asportazione Per quanto piccola la dose si verificheranno sempre delle SSBs ! Nro SSBs  Dose [0.2Gy – 60 MGy] In condizioni di ipossia il Nro SSBs si riduce a 1/3 Nro SSBs indotte attraverso radicali liberi Radiazioni Ionizzanti di basso LET 10 ÷ 20 eV per 1 rottura Riparazione mediante asportazione Tecnica rapida ed efficiente – esente da errori Nelle cellule di mammifero la velocità di riparazione mediante escissione è esponenziale Il processo è controllato enzimaticamente e dipende dalla temperatura: a 0° non avvengono riparazioni. Le SSBs non riparate possono prendere parte alla formazione di DBSs.

Riparazione mediante asportazione delle SSBs Viene asportato il tratto di catena contenente il frammento deficitario di DNA e viene utilizzata il filamento non alterato complementare della catena per la risintesi del nuovo tratto di DNA. Riconoscimento della sede del danno e incisione (endonucleasi) Risintesi (DNA-polimerasi) Asportazione della lesione (esonucleasi) Unione (ligasi)

Rotture di catena doppia — DSBs Possono prodursi per evento singolo ionizzante o per la coincidenza di casuali rotture della catena su catene complementari. Il rapporto tra dose e numero di DSBs indotte  lineare-quadratico ! La sequenza di basi nucleotidiche può non essere disponibile sull’una o sull’altra catena e può non esservi continuità tra le due “estremità libere” IERI: Le DSBs non possono essere riparate e sono necessariamente letali !!! OGGI: È possibile una riparazione “tendente all’errore” Si può solo stabilire se le estremità libere di una molecola di DNA frammentata si sono riunite; non si può stabilire se l’accoppiamento originario di basi è ripristinato.

Sistemi di riparazione delle DSB nelle cellule di mammifero NHEJ HR SSA fase G0 e G1 del ciclo cellulare ci può essere una perdita dell’ informazione genetica — error prone cellule meiotiche cellule mitotiche in fase di Replicazione del ciclo cellulare riparazione esente da errore — error free Può essere vista come una variante dell’ HR In un genoma complesso, dove non tutti i nucleotidi sono codificanti, il rischio associato alla perdita di informazioni per una riparazione non esente da errore è inferiore a quello che si corre se la cellula entrasse nella fase S o M col DNA non riparato

! ! NHEJ DNA-PK = DNA-PKcs + Ku Proteine coinvolte XRCC4 DNA-Ligasi IV XRCC4 esiste in un complesso con la DNA-ligasi IV L’interazione di quest’ultima con XRCC4 stimola l’azione di “ligasi” e forse anche di annealing DNA-Ligasi IV Cellule che mancano di DNA-PKcs o Ku o XRCC4 sono più radiosensibili e difettose nella riparazione delle DSBs ! Cellule che mancano di XRCC4 hanno un basso livello di DNA-ligasi IV  morte per apoptosi !

Si ottengono due singole code HR Proteine coinvolte Rad 52 Complesso endonucleasico Nbs1-Mre11-Rad50 Rad52 riconosce la sede del danno e si lega alle estremità danneggiate dei filamenti del DNA Il complesso endonucleasico taglia dei segmenti di DNA Si ottengono due singole code Una coda invade il filamento fratello del DNA non danneggiato generando una struttura D-loop L’altra può anch’essa invadere il filamento fratello o legarsi semplicemente all’altro capo del filamento del DNA danneggiato Si formano dei legami (giunzioni di Holliday) tra i filamenti appartenenti alla sequenza danneggiata e a quella sana. Le informazioni mancanti nel sito della DSB vengono recuperate da una nuova sintesi del DNA.

Proteine coinvolte Rad 52 Complesso endonucleasico Nbs1-Mre11-Rad50 SSA La riparazione avviene attraverso l’annealing delle sequenze complementari su entrambi i siti di rottura. ! Nella ricerca delle sequenze omologhe da appaiare produce la perdita di larghi frammenti Riparazione non esente da errore

Sindromi associate alla mancanza o alterazione di geni coinvolti nel processo di riparazione delle DSB

Bibliografia Nilsen- Krokan Base excision repair in a network of defence and tolerance Carcinogenesis, Vol. 22, No. 7, 987-998, July 2001 S.P. Lees-Miller, K. Meek Repair of DNA double strand breaks by non-homologous end joining, Biochimie 85 (2003) 1161–1173 Andrej Dudáš, Miroslav Chovanec, Review DNA double-strand break repair by homologous recombination, Mutation Research 566 (2004) 131–167 Peter Karran, DNA double strand break repair in mammalian cells Belli, Sapora, Tabocchini Molecular targets in cellular response to ionizing radiation and implications in space radiation protection Coggle, Effetti Biologici delle radiazioni, Ed. Minerva Medica, Torino 1998 Stephen P. Jackson Sensing and repairing DNA double-strand breaks, Carcinogenesis, Vol. 23, No. 5, 687- 696, May 2002 www.users.rcn/jkinball.ma.ultranet/BiologyPages Gary Roberts , DNA repair mechanisms, Cap.III: DNA repair mechanisms. Edited by Timothy Paustian, University of Wisconins-Madison ©2003 Boreham, Cellular Defense Mechanisms Against the Biological Effects of Ionizing Radiation, IRPA-10, May 2000 Hiroshima, Japan

BER

Strand Break HR 5’ Exonuclease Activity Recombination with intact strand New DNA Synthesis DNA strand unwound annealed and ligated

SSA

l’eterodimero Ku70/80 si lega alle estremità del DNA in corrispondenza della rottura, interagisce con la subunità catalittica PKcs attivandola e legandosi ad essa per formare il complesso DNA-PK Si forma una Sinapsi quando le due molecole di PKcs, ciascuna a una estremità della DSB, mantengono unite le due parti terminali libere del DNA, funzionando come una "struttura di supporto" per l'assemblaggio di altre componenti del complesso sistema di riparo Per il processamento delle parti finali libere del DNA e l'allineamento omologo sono necessari altri enzimi: esonucleasi ed elicasi. avviene il legame tra le estremità del DNA mediante il complesso XRCC4/DNAligasiIV (processo non ancora del tutto chiaro) il complesso XRCC4/DNA ligasi IV è interagisce con il complesso DNA-PK e opera la giunzione avviene il rilascio di tutto la “macchina” proteica

Danno al reticolo endoplasmatico Danno alle membrane Danno al reticolo endoplasmatico Danno ai lisosomi Danno ai mitocondri ?