CCR CARCINOMA DEL COLON RETTO Vincenzo Stanghellini 051.636-4101 v.stanghellini@unibo.it

CCR lifetime risk 5% Hereditary factors Life habits

Nuovi casi / anno (incidenza) Epidemiologia Nuovi casi / anno (incidenza) Esofago Stomaco Colon-retto Nel mondo 150.000 670.000 970.000 In Italia 2.000 10.000 32.000 Età max. incidenza 6a - 7a decade di vita 1:1 Rapporto M:F 3:1 2:1

INCIDENZA DI CANCRO IN EUROPA (N°/ANNO) Source Globocan 2000

INCIDENZA DI CANCRO GI IN EUROPA (N°/ANNO) Source Globocan 2000

SOPRAVVIVENZA A 5 ANNI PER CANCRO GI IN ITALIA (%) Source Globocan 2000

BASSA PREVALENZA DI CCR EREDITARIO Houston et al, BMJ 1990

POLIPI E CCR La maggior parte dei CCR originano da polipi adenomatosi, in seguito a mutazioni che attivaziono oncogeni e inibiscono geni oncosoppressori Probabilità di degenerazione maligna Forma sessile > peduncolata Istologia villoso > tubulo-villoso > tubulare Dimensioni (>2.5 cm) > (1.5-2.5 cm) > (<1.5 cm) Polipi spesso non isolati ma associati ad altri polipi e/o CCR ( 30%) X 3 10% 2-10% <2%

CCR - FATTORI ESOGENI Infiammazione cronica della mucosa intestinale IBD: RCU, Crohn anastomosi uretero-sigmoidea  FANS Fattori dietetici  fibre vegetali  grassi animali  Ca++

ASPIRINA E MORTALITA’ PER CCR RR Popolazione US Health professionals Non consumatori di aspirina Consumatori di aspirina Incidenza CCR Uso regolare sul lungo termine   rischio nell’uomo 2-5 cp/wk 0.72 0.56-0.92 6-14 cp/wk 0.30 0.11-0.81 Chan et al. Gastroenterology 2008;134:21-8

Alimentazione e cancro Argomento molto “caldo” www.yahoo.com: 40.000.000 voci Pubmed: 21.238 voci, 2157 nel 2006

CCR CHEMOPREVENZIONE: DIETA RR Grassi animali Fibre vegetali Consumo quotidiano

CCR CHEMOPREVENZIONE: DIETA RICCA DI FIBRE Diluisce le sostanze cancerogene Fermenta gli acidi grassi a catena corta Accorcia il tempo di transito Lega gli acidi biliari Può contenere agenti anti-cancerogeni

RAZIONALE DELL’APPORTO DI CALCIO CHEMOPREVENZIONE CCR RAZIONALE DELL’APPORTO DI CALCIO Elevato consumo  CCR raro Inibisce la proliferazione dell’epitelio nell’uomo Previene la formazione di adenomi nei roditori

CONSUMO DI CALCIO E RISCHIO DI CCR Casi /100,000 Consumo di Calcio (mg/day) USA Helsinki Rural Denmark Rural Finland Copenhagen

CCR - FATTORI GENETICI

RISCHIO DI CCR IN PARENTI DI PAZIENTI CON ADENOMA/CCR Età del fratello con adenoma n° di genitori o fratelli con cancro RR RR

CCR - PATOGENESI MOLECOLARE  ONCOGENI aumentata espressione, mut.puntiformi  ONCOSOPPRESSORI inattivazione di entrambi gli alleli per delezione cromosomica e/o mutazione puntiforme METILAZIONE DNA disattivazione (silenced expression) di geni che vengono metilati (es.mismatch repair genes)

CCR - PATOGENESI MOLECOLARE  ONCOGENI - K-ras Cr 18 mut.puntiformi 40-70% K – 5-50% adenomi - c-myc Cr 12 aumentata espressione 60-70% K  ONCOSOPPRESSORI (recessivi: entrambi alleli  LOH loss of heterozigosity) - APC Cr 5 perdita allelica 20-50% K – 30% adenomi - MMC Cr 5 delezioni mut.puntiformi 55% K - DCC Cr 18 delezioni 70% K – raro adenomi - Gene p53 Cr 17 perdita allelica 75% K – raro adenomi Accumulo più che la sequenza il determinante principale della progressione neoplastica “tardivi” APC K-ras progressione carcinogenetica in assenza di precursore adenomatoso (es. adenoCa in RCU)

Cr 5 - APC (adenomatous polyposis coli - tumor suppressor gene) APC è stato clonato nel 1991 mediante: a) identificazione delezione interstiziale sul cromosoma 5q in pz con FAP (LOH); b) studi di analisi del linkage Studi successivi hanno dimostrato che APC è fondamentale anche in CCR sporadici (>70% - caratteristica peculiare dei CCR) >90% delle mutazioni del gene APC determinano un segnale di stop prematuro e di conseguenza un prodotto genetico troncato ed inefficace. Tale proteina troncata tipica di APC mutati viene impiegata per lo screening genetico

MODELLO MOLECOLARE DI PROGRESSIONE NEOPLASTICA DEL CRC Delezione DCC Cr 18 (displasia) Attivazione Oncogene Ras Cr 18 Inattivazione p53 Cr 17 Altre anomalie DNA-MMR etc. Inattivazione Oncosoppressore APC Cr 5 Normale Epitelio iperproliferativo Piccolo adenoma Grande adenoma Cancro Metastasi Displasia Lieve  Moderata  Severa

APC/-CATENINA PATHWAY APC  proteina di grandi dimensioni che regola il legame di proteine intracellulari (-catenina, -catenina, GSK-3, exina, tubulina, GB1, hDLG)  degradazione citosolica (fosforilazione) -catenina  proteina che favorisce l’aggregazione intercellulare APC mutato  accumulo citoplasmatico di -catenina -catenina in eccesso  al nucleo dove interagisce con il fattore di trascrizione T-cell (Tcf) determinando up-regulation di vari oncogeni (C-Myc, cyclin D1, PPAR-) (enterociti cripte della mucosa del colon)

APC/-CATENINA PATHWAY Ruolo precoce della via APC/-catenina (riscontro di alterazioni della -catenina, anche in polipi adenomatosi benigni) Alterazioni di -catenina possono portare alla formazione di polipi anche in presenza di APC normale, in quanto “successive” a quelle di APC Peroxisome proliferator-activating receptor gene (PPAR). Inibito dai FANS Oncogene? Modulatore? Codifica per recettori nucleari (regolatori di trascrizione di proteine che controllano il metabolismo dei lipidi e la crescita cellulare). Se attivato  crescita cellulare, ma  differenziazione in cellule neoplastiche

PATHOGENETIC MECHANISMS OF NSAID-GASTROPATHY ARACHIDONIC ACID COX-1 costitutive COX-2 inducible Protective Pg PgI2 Pro-inflammatory Pg PgE2, PgD2, PgF2a Gastric mucosal protection Platlet aggregation Inflammation

PATHOGENETIC MECHANISMS OF NSAID-GASTROPATHY ARACHIDONIC ACID NSAIDS COX-1 costitutive COX-2 inducible Protective Pg PgI2 Pro-inflammatory Pg PgE2, PgD2, PgF2a Gastric mucosal injury  Platlet aggregation Analgesic effect  Inflammation

Drosophila melangoster o mosca comune della frutta Wnt = wingless / intern gene la cui mutazione recessiva si caratterizza con assenza di ali della drosophila melangaster WNT1 WNT2, WNT2B WNT3, WNT3A WNT4 WNT5A, WNT5B WNT6 WNT7A, WNT7B WNT8A, WNT8B WNT9A, WNT9B WNT10A WNT10B, WNT11 WNT16 Geni umani che codificano per proteine Wnt Wnt signaling pathway è un insieme di proteine designate al trasporto di informazioni dalla superficie cellulare al nucledo coinvolte in comunicazioni tra cellule sia nell’embrione che nell’adulto

Fz o FRZ (frizzled) = arricciato, increspato DSH (dishevelled) = arruffato, scapigliato

Wnt (wingless intern gene) Fz o FRZ (frizzled) DSH (dishevelled)

The Wnt/wingless signaling pathway Proteine Wnt si legano a recettori di membrana (G-protein) della famiglia Frizzled (Fz o FRZ) (polarità cellulare)  proteine della famiglia Dishevelled (DSH) (polarità e differenziazione cellulare) β-Cat che può raggiungere il nucleo (Arm)  fattore di trascrizione cellulare (T-cell factor = Tcf)  oncogeni

The Wnt/wingless signaling pathway Dishevelled (DSH) è parte del compesso recettoriale di membrana FRZ per proteine Wnt Wnt/FzDSH  axin/GSK/APC  β-Cat nel citoplasma  β-Cat nel nucleo dove, legando il fattore di trascrizione T-cell (Tcf)  vari oncogeni (COX-2, PPAR-, C-Myc, cyclin D1) NSAIDS ?

Metilazione del DNA Fondamentale fattore epigenetico. Possibile residuo di antiche infezioni virali (normale meccanismo di identificazione self non-self nei virus) Modificazione chimica del DNA (CH3) che può essere ereditata e successivamente rimossa senza modificare la sequenza originale Es: CH3-C5 dell’anello pirimidinico della citosina (  legame con proteine trascrizionali)   espressione genica (tipico di tutti i vertebrati) Fisiologicamente coinvolto nello sviluppo (imprinting, inattivazione cr-X, soppressione di elementi ripetitivi) ma anche carcinogenesi Ipometilazione: precoce;  instabilità cromosomica, imprinting loss (LOI) Ipermetilazione: associata a promoters e spesso indotta da gene (oncogene suppressor) silencing Centinaia di migliaia di geni metilati in ciascuna cellula neoplastica

Cr 18 - Oncogene K-ras H- K- N-ras. K-ras è più frequentemente coinvolto nel CCR Codificano per una famiglia di piccole proteine di transmembrana simili a G-proteins che agiscono come interrutori unidirezionali per la trasmissione di stimoli extra-cellulari di accrescimento nucleare In condizioni fisiologiche oscillano da una forma attiva (GTP-bound) ad una inattiva (GDP-bound). Point-mutations  resisetenza a GTP-ase e fissano la forma attiva  continuo stimolo proliferativo Mutazioni di ras in CCR sporadici (50%), adenomi >1 cm (50%) e solo raramente in adenomi piccoli. Ras mutato nelle feci  possibile test di screening (fasi precoci di CCR)

Cr 17 - Oncosoppressore p53 Gene più frequentemente mutato nelle neoplasie maligne dell’uomo, raramente nelle forme benigne (es. adenomi) In condizioni fisiologiche codifica per attivatore trascrizionale di geni inibitori della crescita (>20) che interviene in condizioni di stress (es. danneggiamento del DNA, O2) per facilitare la riparazione del DNA Previene la propagazione di cellule con DNA danneggiato  “guardiano del genoma” (pro-apoptotico) Indice prognostico quod vitam negativo

CCR – FORME FAMILIARI

SYNDROMI POLIPOSICHE GI EREDITARIE (AUTOSOMICHE DOMINANTI) Sindrome sede istotipo pot. maligno lesioni associate HNPCC colon adenoma comune endometrio, ovaio, ecc. FAP “ “ “ UGI, CNS, tiroide, ecc. Gardner’s intestino “ “ osteomi, fibromi, lipomi, cisti epidermoidi, cancro ampollare Turcot’s colon “ “ tumori cerebrali Peutz-Jeghers tratto GI amartoma raro pigmentazione mucocutanea, tumori di ovaio, mammella, pancreas, endometrio Poliposi giovanile “ amartoma “ varie, congenite >adenoma

FAP familial adenomatous polyposis 1:8.300-14.025 nati vivi Prevalenza 2.3 – 3.2 / 100.000 M:F = 1:1 >100 adenomi del colon e/o adenomi multipli + parente I° FAP 75-80% ha un genitore affetto 0.5-1% CCR (in calo per diagnosi precoce) 100% rischio di evoluzione maligna Mutazioni APC (braccio lungo 5q) (tutte le cellule hanno un allele mutato - la malattia adenomatosa inizia per delezione/mutazione dell’allele inizialmente sano)

ETA’ E SVILUPPO DELLA NEOPLASIA IN FAP 95% pts ha polipi a 35 aa Età media alla comparsa 39 (34-43) FAP % con neoplasia Cancro su Adenoma Sporadico anni Età media all’esordio16 (7-36)

Quando effettuare i test genetici? Persone con caratteristiche incerte di FAP (20 polipi, senza familiarità) Persone con FAP manifesta (100 polipi), ma senza altri casi noti nella famiglia (paternità dubbia?) Parenti di soggetti affetti da FAP con mutazione genetica nota (stessa mutazione in tutti i membri della famiglia – normale rischio di CCR) N.B. La mancata evidenza di mutazioni genetiche non esclude la presenza di FAP (10% falsi –vi)

HNPCC hereditary nonpolyposis colorectal cancer già sindrome di Lynch 0.8 - 1% CCR Rari adenomi del colon in trasformazione maligna 45% sviluppa altri carcinomi colici o extra-colici entro 10 aa dal K colon Instabilità microsatellitare (MSI) Mutazioni MMR (MLH1 – MSH2 - …) >95% dei casi

HNPCC Esordio precoce adenomi pochi o assenti Localizzazioni primitive multiple Carattere autosomico dominante Predominanza nel colon destro Cancro dell’endometrio

CRITERI DI AMSTERDAM PER HNPCC 3. Tre o più membri con CRC 2. Due o più generazioni 80 anni 1. Un membro parente di 1° di altri due 41 anni K. endometrio 54 anni 1. In uno o più membri diagnosi a < 50 anni 22 anni 0. FAP è stata esclusa Tutti i criteri devono essere soddisfatti per la diagnosi di HNPCC

TUMORI EXTRA-COLICI IN HNPCC Keratoacanthoma / neoplasia delle ghiandole sebacee (sindrome di Muir-Torre) Epatobiliare Stomaco Tenue Vie urinarie Endometrio Ovaie

HNPCC CRC Rischio di cancro (%) Endometrio Età

Mismatch repair (MMR) genes Correggono accoppiamenti sbagliati delle basi e piccole inserzioni o delezioni che avvengono durante la replicazione del DNA hMSH2 e 6 (human mutS homolog 2 e 6), hMLH1 e 3 (human mutL homolog 1 e 3), hPMS1 e 2 (human postmeiotic segregation 1 e 2) , hEXOI (human exonuclease I) In HNPCC (mutazioni / perdita allelica) e 20% di CCR sporadici (metilazione regione promoter / loss of imprinting -LOI) Imprinting = perdita selettiva dell’espressione di specifici geni parentali indotta da metilazione di un allele

Struttura DNA Polimero a doppia elica i cui monomeri sono desossiribonucleotidi : Desossiribosio Gruppo fosfato Base azotata puriniche (adenina - guanina) pirimidiniche (citosina - timina)

Modello semplificato di mismatch repair umano hMSH2 forma con hMSH6 un eterodimero che corre lungo la catena di DNA per identificare errori hMLH1 si unisce a PMS2 e, sotto l’effetto di ATP legano hMSH2-hMSH6 Il complesso di 4 proteine e 2 ATP attiva hEXOI ad effettuare la riparazione

Microsatellite instability (MSI) Zone “microsatellitari” (sequenze ripetute di coppie di basi x 10-100) Mutazioni  accumulo di errori nel genoma particolarmente frequenti nelle zone “microsatellitari” che sono particolarmente “pericolose” si trovano anche in geni che controllano la crescita (es. BAX  apoptosi)  microsatellite instability (MSI)

LINEEGUIDA PER TEST GENETICI IN CCR Forte anamnesi di CCR familiare Risultati interpretabili adeguatamente Possibilità di influenzare screening e gestione di pazienti e/o familiari TEST GENETICI DISPONIBILI FAP HNPCC Peutz-Jeghers syndrome (PJS) Familial juvenile polyposis (JPS) http://www.genetests.org consulenza genetica (anamnesi familiare, calcolo del rischio, selezione del test)

Tumor induced in mouse ileum and colon ROLE OF INTESTINAL MICROFLORA ON THE DEVELOPMENT OF TUMOR IN MURINE MODEL FOR IBD OR IBD-CANCER GPX- KNOCK-OUT MICE Glutathion Peroxidase (GPx) Chu, Cancer Res., 2004;64:962-8 Tumor induced in mouse ileum and colon GPX- KO GPX Holoxenic 28/130 (21.5%) 0/84(0%) Germ-free 0/28(0%) 0/11(0%) P53-/- TCRß -/- KNOCK-OUT Kado et al, 2001;61:2395-8 Colon Adenocarcinoma Germ-free Holoxenic P-Value There are several animal models of genetic predisposition to the development of colon cancer. Two of these models have focused on the role of the intestinal microflora in the development of adenomas of adenocarcinomas, by comparing germ-free and holoxenic (i.e. bearing their own microflora) animals. Here above, it is possible to see that in APCmin mice (an animal model for familial polyposis), the microbial status does not strongly alter the adenoma nultiplicity in either small or large bowel, since only in the jejunum there is a higher trend to develop adenomas in the presence of microflora. In other words, a very strong genetic pattern is sufficient to develop adenomas both in the absence and in the presence of bacteria. However, this paper does not take into consideration the progression from adenoma to adenocarcinoma. When we infect APCmin holoxenic mice with a pathogen (Citrobacter Rodentium), adhering to the epithelium of discending colon (with dissolution of brush border adn cytoskeletal re-arrangement), the number of colonic adenomas is significantly higher than in holoxenic ones. This might be due to the strong promotion action of this bacterium which is able to induce a hyperproliferative status of the epithelium. The role of intestinal microflora is much more remarkable in P53—(minus minus) and TCRB – (minus minus) knockout which is considered as a model for cancer development in IBD. It is not suprising that here microflora is playing a more evident role, according to what occurs in the genesis/maintenance of human IBD. Colonic adenocarcinoma occurs only in the presence of bacteria, while germ-free life protects animals from disease. Incidence % 70% <0.05 N° of Adenoca./ mouse 0.8±0.8 <0.05

Human Microbiota A human supraorganism ~20,000 Genes protein-coding > x10 eucariote cells encode 9x106 genes 450-fold more than human genome ~20,000 Genes protein-coding A human supraorganism 1000-1150 bacterial species identified Each individual harbours 1-1.5 Kg of microbiota Each individual harbours >160 species >57 species common to >90% of individuals Turnbaugh et al, Nature 2007; Qin et al, Nature 2010

Effetti del microbiota nell’uomo Fisiologici Normale sviluppo GI Adattamento immunologico Protezione da patogeni Digestione polisaccaridi Assorbimento lipidico Metabolismo di carcinogeni … Patologici Alterate funzioni digestive CCR IBD SIBO IBS Colite da antibiotici Enterite necrotizzante Steatosi epatica Obesità Abnorme percezioni dolorose Turbe psicologiche …