MSc project title : Use of biological scaffolds for 3D-modelling analysis and in vitro osteogenic differentiation methods and implementation Candidata: Giovanna Lo Conte Relatore : Dr. Marcello Bracale Correlatori: Dr. Paolo Gargiulo e Dr. Ólafur E. Sigurjónsson

INTRODUZIONE L‘ingegneria dei tessuti è un campo multidisciplinare che grazie all‘uso della combinazione delle cellule, l‘ingegneria, la biochimica copre un ampio range di applicazioni. Lo scopo principale dell‘ingegneria dei tessuti è la creazione di sostituti biologici (ossa, cartilagine, pelle, vasi sanguigni,etc) che una volta impiantati mantengono o migliorano le caratteristiche dei tessuti danneggiati. L‘ingegneria dei tessuti usa cellule viventi come materiali ingegnerizzati. La fabbricazione dei tessuti in laboratorio è ottenuta dalla combinazione di cellule, matrici extracellulari ingegnerizzate (scaffolds) e molecole biologicamente attive.

INTRODUZIONE Allo stato attuale della tecnologia il metodo più comune per esaminare le cellule sugli scaffolds è il microscopio elettronico. Esso permette un’analisi 2D della superficie di tali strutture e non permette una visione interna degli scaffolds. Per vedere la parte interna degli scaffold è realizzare un sezionamento seguito da un analisi istologica, ma tale tecnica è distruttiva, noiosa e semi-quantitativa. Questo progetto nasce dall’esigenza di voler superare tali limiti e di voler trovare un nuovo strumento di analisi che consenta di ottenere le informazioni delle tecniche attualmente utilizzate in maniera non distruttiva e quantitativa.

OBIETTIVI Il primo obiettivo è vedere se con la tecnologia della µCT è possibile monitorare i cambiamenti intracellulari che avvengono su differenti tipi di scaffolds OPLA (open-cell polylactic acid) e CaP (Calcium Phosphate) inseminati da cellule mesenchimali staminali MC3T3-E1. Il secondo obiettivo è la progettazione di uno scaffold che consenta l’ottimizzazione della crescita in vitro delle ossa e realizzazione di un prototipo dello scaffold usando una stampante 3D. Scaffold CaP

METODO: Set up MC3T3-E1 Le cellule staminali MC3T3-E1 sono una linea cellulare proveniente da un piccolo roditore (Mus Musculus). Queste cellule staminali, dopo un programma di differenziazione degli osteoblasti in vitro, possono produrre una matrice mineralizzata come quella ossea[2]. Le cellule staminali MC3T3-E1 sono coltivate in un medium di coltura (α- MEM), senza acido ascorbico, con l’aggiunta del 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotico (contenente penicillina) MC3T3-E1 al microscopio [2] Jane B. Lian, Victoria Shalhoub, Fauzia Aslam, Baruch Frenkel, Jack Green, Michael Hamrah, Gary S. Stein and Janet L. Stein (1997): Species-Specific Glucocorticoid and 1,25-Dihydroxyvitamin D Responsiveness in Mouse MC3T3-E1 Osteoblasts: Dexamethasone Inhibits Osteoblast Differentiation and Vitamin D Down-Regulates Osteocalcin Gene Expression.1997 May;138(5):

METODO: Set up scaffolds Prima della semina delle cellule sugli scaffold, essi sono disposti in un multiwell con 24 pozzetti, sono bagnati con una soluzione di PBS (tampone fosfato salino) e fibronectina (che induce l’attaccamento delle cellule su di essi) e poi sono incubati per un ora. Per la semina degli scaffolds sono usate approssimativamente cellule in una soluzione di volume totale di 150 µl.

METODO : differenziazione osteogenica Le cellule inseminate sugli scaffolds sono coltivate con un media per la differenziazione osteogenica (D- MEM/F12) con l’aggiunta di acido ascorbico (che induce la formazione di collagene), β- glycerolphasfate (che induce la calcificazione del collagene) e siero fetale bovino (FBS). La cultura è mantenuta in un incubatore a 37° in un atmosfera umidificata contenente 5% CO2 e il media è cambiato ogni due giorni. dopo 2 giorni

ANALISI SUPERFICIE SCAFFOLD CON IL MISCROSCOPIO Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane) Scaffold CaP con cellule al microscopio Leica DM-IRB Inverted Research Microscope

ANALISI CELLULE E MATRICE CON IL MISCROSCOPIO Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane) Scaffold CaP con cellule al microscopio dopo il sezionamento e la colorazione

ANALISI CALCIFICAZIONE CON IL MISCROSCOPIO Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane) Scaffold CaP con cellule al microscopio dopo il sezionamento e la colorazione

SCANSIONE CON µCT E RICOSTRUZIONE 3D µCT Phoenix Nanotom s GE software phoenix datos|x Scaffold CaP dopo la ricostruzione 3D con datos|x Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane) Caratteristiche da indagare dopo 8 settimane: -struttura 3D dello scaffold -dimensione dei pori - proprietà dell’attaccamento delle cellule allo scaffold -distribuzione della formazione della matrice mineralizzata (mineralizzazione)

METODO Definito un protocollo di scansione degli scaffolds Definito un protocollo di ricostruzione 3D degli scaffolds Usando lo standard DICOM ( Digital Imaging and COmmunications in Medicine ) per portare i dati dell’ immagini 3D in ambiente Mimics. Sarà necesario stabilire un protocollo per l‘analisi 3D di tali strutture in ambiente Mimics, per poter ricavare informazioni e confrontarle con quelle delle tecnologie attualmente usate. Dati scansione V=120kV I=100µA T=2000ms

Nella seconda parte del mio lavoro, partendo dall'ipotesi[3] che è possibile riuscire a catalizzare la dinamica di crescita cellulare attraverso la stimolazione meccanica, voglio ottimizzare il processo modificando le caratteristiche degli scaffolds (forma, porosità, materiale). Voglio realizzare, infine, un prototipo dello scaffold usando una stampante 3D (ZPrinter 450) che è in grado di generare modelli tridimensionali partendo da disegni realizzati usando dei programmi di modellazione. [3] Ulrich Meyer, Thomas Meyer, Jorg Handschel, Hans Peter Wiesmann (2009) Fundamentals of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Springer-Verlag Berlin Heidelberg OTTIMIZZAZIONE E PROTOTIPIZZAZIONE