Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica Impatto dell’eritropoietina e della riossigenazione su cellule tumorali testa collo irradiate in ipossia Presentata dalla Dott.ssa Monica Maffi Co-relatore Prof. Gianpiero Pescarmona

HNSCC gruppo di tumori solidi localizzati della linea epiteliale della cavità orale, faringea e della laringe fattori di rischio: fumo, alcool, HPV, EBV over-espressione di EGFR associata a radioresistenza trattamento antiblastico: radio-chemio terapia integrata, causa di comparsa di anemia Marur and Forastiere, 2008 Modello ideale per studiare l’impatto dell’anemia e dell’ipossia tumorale in risposta alla radioterapia

IPOSSIA E TUMORI proprietà patofisiologica di molti tumori solidi localmente avanzati: pO2 ≤ 2.5mmHg necrosi tumorale causata da scarsa vascolarizzazione adattamento del tumore all’ipossia: modifica del fenotipo cellulare e promozione del metabolismo anaerobico ipossia induce over-espressione di EGFR risposta in vivo di tale adattamento all’ipossia: perdita controllo apoptosi, proliferazione tumorale, angiogenesi e radioresistenza L’anemia associata ai tumori contribuisce allo sviluppo dell’ipossia e alla radioresistenza

EPO ricombinante (rHuEPO) è utilizzata per trattare pazienti enemici Eritropoietina (EPO) ormone glicoproteico essenziale di circa 30.4 kDa fam. di citochine di classe I struttura: 4-α eliche gene: 5 esoni sul cromosoma 7 (uomo) fattore di crescita eritroide in ipossia aumenta di circa 1000 volte l’m-RNA di EPO EPO ricombinante (rHuEPO) è utilizzata per trattare pazienti enemici

Uno dei geni transattivati dal legame di HIF1 all’HRE è il gene che codifica per l’EPO Recettore nucleare  ipossia +  HIF1 nucleo Gene EPO p300 HNF4 Adattatore trascrizionale

Pathways attivati da EPO/EPOR: Omodimerizzazione di due mol di EPOR Tirosine fosforilate che fungono da ponte e attivano prot Src homology come STA5 e PI3K Segnale spento da feedback – indotto da fosfatasi cells ematopoietiche SH1 che deP JAK2 e inattiva EPOR L’effetto biologico di EPO è mediato dal suo legame con EPOR espresso sia sulla superficie delle cells progenitrici della linea eritroide sia su molti tipi cellulari non ematopoietici tra cui cells tumorali. Pathways attivati da EPO/EPOR: JAK2/STAT5: si formano dimeri di STAT che traslocano nel nucleo dove attivano trascrizione di geni target che inducono differenziazione eritroide RAS/PI3K: pathways che attiva AKT e P70 che inducono trascrizione genica e progressione del ciclo cellulare

EPO e tumore dati clinici ottenuti da trial effettuati da diversi centri su pazienti affetti da tumore testa collo evidenziano un impatto negativo di EPO sul controllo tumorale e sulla sopravvivenza in pazienti affetti da SCCHN trattati con EPO e radioterapia up-regolazione di EPO in differenti cellule tumorali tra cui HNSCC Henke M, Laszig R, Rube C, Schafer U, Haase KD, Schilcher B, Mose S, Beer KT, Burger U, Dougherty C, Frommhold H. Erythropoietin to treat head and neck cancer patients with anaemia undergoing radiotherapy: randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 2003; 362: 1255-60.

Scopo del progetto esaminare la relazione esistente tra ipossia, livello di espressione di EPO/EPOR e di EGFR e i loro effetti sulla risposta cellulare a RT la causa della proliferazione cell e dello sviluppo tumorale in pazienti anemici può essere la somministrazione di rHuEPO? Disegno sperimentale in vitro studiato per approfondire l’impatto della riossigenazione e di EPO sulla sopravvivenza cellulare in ipossia dopo RT (cells esprimono EPOR)

Disegno sperimentale

Analisi di citotossicità controllo epo Ipossia 24h Ipossia 24h + epo Ipossia 24h + reox 24h Ipossia 24h + reox 24h + epo ipossia 48h ipossia 48h + epo 50 100 no radio radio % SF % SF= Percentage of survival fraction

Espressione di EPOR a livello di m-RNA Esposizione a EPO Ipossia L’ipossia incrementa l’espressione genica di EPOR. Il trattamento con EPO aumenta m-RNA di EPOR, il livello di espressione diminuisce dopo RT. La riossigenazione non ha alcun effetto su EPOR. Riossigenazione

Espressione della proteina EPOR L’ipossia e l’esposizione a EPO inducono l’espressione di EPOR RT amplifica l’espressione di EPOR ma non modifica l’effetto dell’ipossia. La riossigenazione amplifica l’espressione di EPOR.

Espressione di EPOR sulla membrana Il livello basale di EPOR nelle cellule CAL166 è uguale a zero. Sia EPO che ipossia inducono una minima espressione di EPOR sulla superficie cellulare (da 200 a 600 recettori per cell).

Stimolo proliferativo: espressione dell’m-RNA di EGFR Esposizione a EPO Ipossia Riossigenazione L’ipossia induce la trascrizione di EGFR, ma il suo livello ritorna basale dopo RT. L’aggiunta di EPO non ha effetti sull’espressione di EGFR. La riossigenazione sembra contrastare gli effetti delle RT.

Espressione e attivazione di EGFR Non si ha modulazione sulla quantità totale di EGFR, mentre il livello di fosforilazione incrementa ad ogni trattamento con un massimo dopo 24h di ipossia. La somministrazione di EPO in normossia up-regola sia l’espressione sia l’attivazione.

Il ruolo di AKT AKT totale è indotto sia dall’ipossia sia da RT sia da EPO ma non dalla riossigenazione. AKT è fortemente indotto da EPO dopo 24h di ipossia.

Apoptosi Le caspasi 3 e 9 sono attivate sia da EPO che dall’ ipossia. La riossigenazione, soprattutto a tempi brevi, induce un aumento dell’apoptosi.

Meccanismo di riparo del DNA L’EPO, la RT e l’ipossia da sola up-regolano l’espressione di XRCC1. La somministrazione di EPO in ipossia annulla questo effetto. La riossigenazione non ha effetti su cell trattate con EPO e RT ma amplifica l’effetto di XRCC1 in ipossia.

Conclusioni EPOR, nella linea CAL166, è localizzato nel citosol e non sulla superficie cellulare, almeno in condizioni fisiologiche. L’espressione di EPOR nel modello cellulare analizzato non sembra essere essenziale per la loro crescita La riossigenazione abbatte la radioresistenza indotta dall’ipossia; al contrario la somministrazione di EPO dopo ipossia non compromette l’efficacia della RT L’amplificazione osservata del segnale di EGFR contribuisce alla radioresistenza inducendo la proliferazione cellulare, regolando il meccanismo di riparazione del DNA e attivando i pathways MAPK e PI3K Si può ipotizzare che l’attivazione di EGFR sia il meccanismo utilizzato da EPO per mediare la sopravvivenza cellulare in condizioni ipossiche in vivo L’attivazione del pathway apoptotico potrebbe essere un segnale indotto da EPO che si contrappone a quello proliferativo (EGFR/AKT) L’EPO nel nostro studio non stimola la proliferazione delle cells CAL166 né in normossia né in ipossia e non risulta nemmeno interferire con l’effetto antiproliferativo citotossico e/o apoptotico delle radiazioni

Progetti futuri altre linee cell radioresistenti (in particolare HNSCC). Co-coltura con cellule endoteliali per studiare l’impatto di EPO sul microambiente circostante il tumore. EPO potrebbe anche attivare altri pathways della linea eritroide come TRPCs e il suo effetto potrebbe essere modulato da micro-RNAs. Inibitore di EGFR (anticorpi monoclonali o inibitori tirosina chinasici come Iressa o Erlotinib) somministrato in combinazione con EPO e RT: se diminuisce radioresistenza allora EPO induce over-espressione di EGFR e conseguente proliferazione cells tumorali.

Impact of erythropoietin on the effects of irradiation under hypoxia. Lo Nigro C., Maffi M., Fischel JL., Monteverde M., Catarsi P., Tonissi F., Lattanzio L., Riba M., Etienne MC., Formento P., Milanò G., Merlano M. Impact of erythropoietin on the effects of irradiation under hypoxia. Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 2009; 135:1615-1623.

Ringraziamenti Federica Tonissi Martino Monteverde Francesca Cavicchioli Laura Lattanzio Lo Nigro Cristiana Laboratorio Oncologia Translazionale ASO S. Croce Cuneo Marco Merlano SC Oncologia Jean Louis Fischel Patricia Formentò Gerard Milanò Laboratoire d’Oncopharmacologie Centre Antoine Lacassagne, Nice

Effetto delle citochine sulla sintesi di EPO indotto in ipossia Neoplasie: linfociti T e monociti producono citochine che inducono aumento di sintesi epatica di proteina C reattiva, fibrinogeno. Ipossia da un lato induce eritropoiesi dall’altro down-regola epcidina (blocca assorbimento del ferro) tramite induzione di EPO. Le citochine (TNF-alfa, INF-gamma e IL-1) concorrono all’insorgenza dell’anemia inibendo EPO indotta in ipossia (in cells tumorali). In contrasto la citochina IL-6, in modelli cellulari tumorali, stimola la produzione di EPO in ipossia. Questi mediatori cell potrebbero essere degli importanti regolatori sulla produzione di EPO in vivo. Questo potrebbe spiegare i risultati discordanti osservati in pazienti trattati con EPO affetti da tumore. Nel nostro studio non ho approfondito lo stimolo di produzione di EPO da parte di IL6 o da altre citochine ma potrebbe essere interessante valutare il ruolo in vivo di IL6 come modulatore dell’espressione di EPO.

Esperimenti preliminari Valutare la IC50 di differenti linee cellulari in rapporto a diverse dosi di raggi X e ad esposizione alle condizioni ipossiche %SF hep2 CL EPO HYP24 HYP24+EPO HYP24+RIOX HYP48 HYP48+EPO 50 100 140 OD %SFcal166 NO RT RT %SF cal33 130 od Radiation effect on OD 5 10 15 20 25 1 2 3 4 CAL33 CAL166 Hep2 irradiation Gy OD % SF under hypoxia 10 20 30 40 50 100 150 cal33 normossia cal33 ipossia cal166 normossia cal166 ipossia Hep 2 normossia Hep2 ipossia Durata ipossia O.D

(EPO,VEGF,NOS,enzimi glicolisi, tirosina idrossilasi) Catalizzata da un set di enzimi (tipo digossigenasi) che vengono attivati solo in presenza di O2 In ipossia non avviene idrossilazione, Hif è stabile e trasloca nel nucleo: eterodimero Proteina Von Hippel Lindau Interazione necessaria affinchè avvenga l’ubiquitinazione di HIF da parte del complesso E3-ubiquitina ligasi e la conseguente inattivazione proteolitica e degradazione da parte del proteasoma 26S HIF1 lega HRE di geni target (in promotore o enhancer) e ne promuove la trascrizione (EPO,VEGF,NOS,enzimi glicolisi, tirosina idrossilasi)

Espressione m-RNA di HIF1α L’espressione di HIF1α diminuisce in ipossia. RT aumenta l’espressione di HIF1α. EPO da solo e in combinazione con riossigenazione aumentano m-RNA di HIF1α. La riossigenazione non ha effetto

Espressione della proteina HIF1α L’ipossia non ha effetto sull’espressione della proteina HIF1α. HIF1α è fortemente indotto da RT, riossigenazione e EPO.

Apoptosi Nessun effetto evidenziabile sul livello di espressione di Bcl2 e Bax.

p21 Solamente l’ipossia induce una up-regolazione di p21.