Infiammazione e cancro Introduzione Evidenze di legame infiammazione-cancro Perché infiammazione aumenta rischio tumore Via intrinseca/ Via Estrinseca Oncogeni e infiammazione Relazione infiammazione cancro: il caso di NF-kB

Il cancro é una malattia causata da difetti nei meccanismi cellulari di controllo della stabilitá del genoma e e della proliferazione cellulare Se infiammazione é in grado di stimolare lo sviluppo del cancro, questo deve avvenire attraverso la modulazione di tali meccanismi cellulari Tra i vari pathway attivati durante infiammazione, NF-kB ha un ruolo centrale sia nel controllo della risposta infiammatoria che nello sviluppo del tumore.

NF-kB NF-kB é un fattore trascrizionale rapidamente attivato in risposta a infezione, infiammazione e stress (danno al DNA) Regola -attivazione dei linfociti -infiammazione -inibisce apoptosi -stimola crescita cellulare

Le subunitá possiedono il dominio REL di legame al DNA REL (la piú importante: REL-A o p65) p50 p52, derivata da proteolisi di p105 Esiste come Etrodimero di due tipi: REL/p50 REL/p52 stress infiammazione

NF-kB pathway canonico citoplasma NF-kB ha segnali di localizzazione nucleare NF-kB é mantenuto nel citoplasma da interazione con IkB In seguito a stimolo, il complesso IkB Chinasi (trimero IKK ) inattiva IkB NF-kB entra nel nucleo nucleo

pathway canonico

Come inattivare NF-kB? Forma mutante di IkB che non púo essere inattivata (fosforilata): I-kB SR: Super Repressore costitutivo!!!!

Pathway non canonico

Geni target feedback loop: IkB proliferazione: MYC, Ciclina D1 anti-apoptosi: BCL2 family (bloccano BAX), cIAP (bloccano caspasi) Infiammazione: citochine (e.g., IL-1, IL-6, TNF-a, IFN b, GM-CSF) chemochine (e.g., IL-8, MIP-1 , MCP1, RANTES, and eotaxin), molecole per adesione (e.g., ICAM, VCAM, and E-selectin) effettori, stress ossidativo (e.g., iNOS and COX-2). risposta immunitaria (MHC proteins) proteasi (MMP9 proteins)

NFKB ha un ruolo sia in cellule infiammatorie che in cellule tumorali

NFKB, infiammazione e cancro Indizi: NF-KB é fondamentale per il processo infiammatorio NF-kB é un attivatore di geni anti apoptotici=oncogeni Tumori umani presentano NF-kB costitutivamente attivato validazione del ruolo di NF-kB in modelli murini Epatite e carcinoma del fegato (HCC:hepatocellular carcinoma) Carcinogenesi chimica e HCC

Hepatocellular Carcinoma (HCC)

High mortality rate due to late stage diagnosis -resection and transplantation are mostly ineffective -Commonly used drugs are mostly ineffective -emergence of therapy resistance tumor -Increse incidence due to increase rate of HBV HCV infection Prevention!

L'epatite virale è un processo infiammatorio (acuto o cronico), che provoca la morte (necrosi) delle cellule del fegato (epatociti) a causa dell'attacco da parte di virus epatotropi (HBV/HCV) Come risponde l’organo danneggiato?

fegato: capacitá rigenerante iperplasia controllata Gli epatociti si dividono raramente. Tuttavia, possiedono la capacità di riprodursi in risposta a: - fattori di crescita - distruzione/asportazione di una parte del fegato stesso Capacitá fondamentale dopo l'asportazione chirurgica o in seguito a lesioni (lesioni virali, tossiche o ischemiche). la capacità di rigenerazione del fegato viene compromessa da danno eccessivo: - malattie croniche (epatite) - danni ripetuti (alcol: >50g/giorno/piú anni) Conseguenza: epatociti verranno sostituiti da tessuto cicatriziale (fibrosi) fino a portare alla cirrosi epatica.

Ripopolazione del fegato e cancro commento Ripopolazione del fegato e cancro Un ambiente ricco in stimoli proliferativi puó favorire la selezione di una cellula “iniziata” (pre tumorale)

Infiammazione - tumore Colangite Infiammazione vie biliari Hepatocellular carcinoma

Topi MDR2-/- Modello murino di epatite Malattie epatobiliari: Gli epatociti secernono la bile nei canalicoli biliari, che sono spazi tra epatociti adiacenti. La bile é composta da acidi biliari e fosfolipidi. MDR2: glicoproteina di membrana che media la secrezione dei fosfolipidi della bile, famiglia degli ABC transporter. Topi MDR2 -/- : Un difetto nella secrezione della bile: acidi biliari in assenza di fosfolipidi,che sono ritenuti negli epatociti, sono tossici e causano danno delle membrane e epatite modello di malattia epatobiliare, é considerato un modello di malattia cronico del fegato, precisamente di Colangite, cioé infiammazione delle vie biliari. All’etá di 4 - 6 mesi i topi mdr2 (-/-) sviluppano foci di HCC.

Topi MDR2-/- Modello murino di epatite

NF-kB e HCC in topi MDR2-/- Sistema: Topi MDR2 -/- sviluppano epatite e poi HCC a 6 mesi Domanda: quale ruolo per NF-kB? Metodo: Inattivazione di NF-kB nel fegato di topi MDR2-/- Come?: Attivazione specifica nel fegato di IkB super-repressor

NF-kB é attivato nei topi MDR2-/- HCC from -/- +/+ Immunoistochimica con antiNF-KB (p65)

Cosa succede se inattiviamo NF-kB Cosa succede se inattiviamo NF-kB? (attivando IkBSR con sistema TET-OFF) In assenza di DOX, il gene é acceso, ikBSR inattiva NF-kB In presenza di DOX, il gene é spento, NF-kB é attivo IkBSR IkBSR In presenza di DOX, il gene é spento, NF-kB é attivo In assenza di DOX, il gene é acceso, ikBSR inattiva NF-kB

IkBSR inibisce NF-kB nel fegato Staining nucleare di p65 é indice di attivitá di NF-kB: KO = MDR2-/- DM = MDR2-/-, IkBSR

Se inattiviamo NF-kB? (attivando IkBSR) meno HCC! IkbSR acceso MDR2-/- IkbSR spento MDR2-/- MDR2-/-

In che modo NF-kB favorisce lo sviluppo di HCC Una funzione di NF-kB é inibire apoptosi. Ipotesi: NF-kB favorisce HCC perché inibisce apoptosi Se cosí fosse, IkBSR dovrebbe far diminuire HCC perché aumenta il livello di apoptosi. Quindi: Qual é il livello di apoptosi in topi MDR2-/- rispetto a topi MDR2-/- con NF-kB inattivato (da IkBSR)?

modello MDR2-/- epatite dox IkBSR NF-kB apoptosi HCC

Se blocco TNF, blocco NF-KB: tolgo l’inibizione dell’apoptosi, Inibizione di NF-kB (da parte di IkBSR) aumenta apoptosi e riduce incidenza HCC Se blocco TNF, blocco NF-KB: tolgo l’inibizione dell’apoptosi, e apoptosi aumenta.

Quali geni target di Nf-kB? Famiglia IAP: legandosi alle caspasi (anche già attivate) ne inibiscono l’attività enzimatica e ne promuovono ubiquitinazione e degradazione

Quali cellule producono TNF e quali hanno NF-kB attivato? epatociti endotelio TNF macrofagi

NFKB funziona sia in cellule infiammatorie che in cellule tumorali

MODELLO di carcinogenesi chimica di HCC NF-kB, cellule e citochine infiammatorie

Carcinogeni e HCC: DEN diethylnitrosamina DNA alkylation Induzione HCC in topi adulti: -Trattamento singolo DEN -Trattamento con promotore per 6 mesi -Comparsa HCC intorno ai 6-8 mesi HCC DEN promotore mesi

DANNO HCC

DANNO HCC Ruolo NF-kB

Produzione di IL6 TLR DEN HCC Attivazione macrofagi Stimolazione cell tumorali CELLULE NECROTICHE

Trattamento con DEN induce proliferazione (ripopolamento) nel fegato Proliferazione é dipendente da NF-kB Wt NF-kB-/- Proliferazione misurata nel fegato come % di cellule positive alla BrdU

Il trattamento con DEN induce IL6 Questa induzione dipende da NF-kB WT NF-kB-/- Immunoistochimica per IL6 su sezioni di fegato da topi wt o NF-kB -/-

Funzione di IL6 in HCC indotta da DEN: IL6 é richiesta per la proliferazione indotta da DEN Proliferazione misurata nel fegato come % di cellule positive alla BrdU

Funzione di IL6 in HCC indotta da DEN: IL6 é richiesta per sviluppo del tumore

E quindi aumenta il survival se togliamo IL6

Quali sono le cellule responsabili? Kupffer celI (KC): i macrofagi residenti del fegato! KC isolate e trattate in piastra con LPS o frammenti necrotici: producono IL6 solo se la via di trasduzione del TLR4 é integra

NB: naturalmente fonte di “tissue damage” é anche epatite

conclusioni Le cellule e i mediatori dell’infiammazione sono una presenza importante dell’ambiente tumorale Lo stato infiammatorio favorisce insorgenza e progressione del tumore - Infiammazione precede e favorisce l’insorgenza del tumore - Attivazione oncogenica induce un’ambiente infiammatorio che favorisce la tumorigenesi

“therapy induced inflammation” Ulteriore livello di complessitá Chirurgia-chemioterapia-radiazioni: Le principali opzioni terapeutiche  inducono infiammazione sistemica o locale Causa: danno tissutale o morte di cellule tumorali Chirurgia: danno tissutale /infezioni – stress pathway chemioterapia-radiazioni: induzione di necrosi ______________________________ NB: Necrosi può avere duplice effetto: Morte di cellule infiammatorie pro-tumorali cellule responsabili del microambiente infiammatorio Morte di cellule infiammatorie anti-tumorali cellule effettrici della risposta immunitaria anti-tumorali

Agire sull’infiammazione pro-tumorale: strategie. Terapia anti-infiammatoria come terapia antitumorale Farmaci antiinfiammatori possono avere sia azione profilattica che terapeutica riducono incidenza o rallentano la crescita tumorale: Inibitori delle ciclo-ossigenasi (aspirina, inbitori di COX2): riduzione incidenza Colon Cancer, Breast cancer Agire sull’infiammazione pro-tumorale: strategie. Inibizione di dei pathway che mediano la crescita/sopravvivenza delle cellule tumorali in risposta alle citochine infiammatorie Sequestro delle citochine /chemochine/recettori che mantengono il microambiente infiammatorio (antiIL6, anti TNF, anti CCR2) modulare la risposta infiammatoria che segue la terapia Eliminare cellule infiammatorie responsabili della progressione tumorale, preservando le cellule responsabili della risposta immunitaria Inibizione selettiva di citochine pro-tumorali.