La ricerca delle aflatossine totali nel mais Con metodo HPLC

Normativa Per quanto riguarda il mais per uso alimentare umano, i limiti di aflatossine (in µg/Kg) sono contenuti nel Reg. CE 1881 del 2006 mais da sottoporre a selezione o altro trattamento prima del consumo o del suo utilizzo come ingrediente per alimenti → AFB1=5,0; totali=10,0 Cereali e derivati, tra cui i prodotti alimentari a base di cereali → AFB1=2,0; totali=4,0

Normativa Per quanto riguarda l’uso mangimistico per animali i limiti di AFB1 (in ppm di prodotto con umidità al 12%) sono contenuti nel D.Lgs. 149 del 2004 Tutte le materie prime ad uso mangimistico → 0,02 Prodotti per bovini, capre e pecore → 0,02 (tranne prodotti per bestiame da latte → 0,005 e prodotti per agnelli e vitelli → 0,01) Prodotti per polli e maiali (tranne quelli giovani) → 0,02 Altri prodotti completi → 0,01 Prodotti aggiuntivi per bovini, capre e pecore (tranne i prodotti aggiuntivi per bestiame da latte, agnelli e vitelli) → 0,02 Prodotti aggiuntivi per maiali e polli (tranne quelli giovani) → 0,02 Altri prodotti aggiuntivi → 0,005

Il principio del metodo Per estrarre le aflatossine dal campione da analizzare si utilizza cloroformio; dopo aver filtrato, per purificare una parte del filtrato si utilizza una cartuccia di florisil e poi una di C18; La separazione e la determinazione successive si effettuano con sistema HPLC, utilizzando una colonna C18 a fase inversa, poi si effettua una derivatizzazione con una soluz. di iodio satura e, infine, una quantificazione, utilizzando un rivelatore a fluorescenza.

I reattivi Cloroformio stabilizzato con etanolo (allo 0,5 – 1%) Metanolo Propanone (acetone) Soluzione acetonelacqua (98:2) Soluzione acqualmetanolo (80:20) Soluzione acqualacetone (85:15) Eluente per HPLC, costituito da una soluzione acqualmetanolo/acetonitrile (130:70:40), i tre solventi devono essere per HPLC Soluzione di iodio satura in acqua (2 g di iodio in 400 ml di acqua, agitazione magnetica almeno per 2 ore e filtrare) Celite 545 o simile trattata con acido Cartucce di florisil Cartucce di C18 Standard di aflatossine Standard di aflatossine da 1 μg/ml circa

Concentrazione con metodo spettrofometrico A = assorbanza Registrare lo spettro ultravioletto della soluz. nell’intervallo 330 - 370 nm contro la soluzione benzene/acetonitrile (9:1); trovare l‘A del pto. di massimo e trovare la concentraz. con la questa formula: AF(μg/ml)= (A ∙ PM ∙ 1000) / E A: assorbanza nel pto. di max PM: peso molecoare dell'AFB1 E: coeff. di estinz. molare

PM e E delle principali aflatossine B1 312 19.800 B2 314 20.900 G1 328 17.100 G2 330 18.200 M1 18.815

reattivi Infine, per quanto riguarda la soluz. di calibrazione, prima del suo utilizzo, portare lo standard da 1 μg/ml alla T ambiente; trasferirne una parte in recipiente tarato, in modo da poter ottenere uno standard diluito da 4 ng/ml circa di AF in acqualacetone. Usare questo standard diluito per ottenere da esso una serie di soluz. di calibrazione. Mantenerle alla temperatura di 4 °C e al buio. Preparando gli standard ed effettuando le analisi, bisogna evitare l’esposizione alla luce diretta e la presenza di NaClO sotto forma di vapore, che possono decomporre le AF. La vetreria nuova va sottoposta a trattamento, utilizzando una soluz. 2 N di acido solforico per 12 ore, prima di poter essere lavata normalmente.

L’apparecchiatura Tritacarne Agitatore meccanico Bilancia analitica Rotavapor Carta da filtro a pieghe con diametro 24 cm o un’altra simile Filtro con pori di diametro 0,45 fvn Colonna di vetro, con un diametro interno di 1 cm circa e una lunghezza di 30 cm circa con attacco luer Rubinetto di nylon con attacco luer Siringa da 10 ml con attacco luer Cromatografo HPLC

L’apparecchiatura Colonna C18 per HPLC da 311 o da 5 u Pompa HPLC per la soluz. di iodio Collegamento a T in acciaio inox, Vmorto zero da 1/16 per 0.75 nun Spirale di reaz. in teflon o in acciaio inox, avente delle dimensioni comprese tra 300 x 0.5 mm e 5000 x 0.5 mm Bagno termostato a olio o acqua a 60 °C con regolazione della temperatura (± 0.1 °C) Rivelatore a fluorescenza con λ di eccitazione = 365 nm ed emissione = 435 nm, mentre per gli strumenti a filtri l’emissione è < 400 nm; usare anche un regolatore di contropressione per evitare la formazione di bolle d’aria nella cella a flusso. Integratore elettronico

Avvertenza AF = aflatossine Le aflatossine sono cancerogene e quindi devono essere maneggiate con molta prudenza. L’analisi va quindi eseguita, rigorosamente, sotto cappa, indossando guanti in lattice di gomma; utilizzare il più possibile degli standard di aflatossine in soluzione acquosa, evitando quindi quelli portati a secchezza. Infatti queste sostanze, essendo particolarmente elettrostatiche, potrebbero diffondersi molto facilmente nell‘ambiente circostante. In caso di versamento accidentale di soluz. di AF, bisogna detergere con una soluz. di NaClO all'l %, lasciare reagire per 10 min e successivamente utilizzare una soluz. al 5% di acetone. Sciacquare tutta la vetreria utilizzata con MeOH, aggiungere la soluz. all’1% di NaClO e successivamente, passate due ore, aggiungere acetone fino al 5% del tot. Fare reagire per 30 min e poi lavare con cura.

Il procedimento: preparazione del campione ed estrazione Macinare completamente il campione e renderlo omogeneo Estrarre 50 g di campione, utilizzando 250 ml di CHCl3 e 25 ml di acqua deionizzata, in una beuta con tappo smerigliato, e aggiungere 25 g di celite, che funge da coadiuvante di filtrazione(cioè un materiale ausiliare nel proc. di filtraz. che serve principalmente a conferire incomprimibilità e porosità al deposito di particelle solide che si accumula sul mezzo di filtrazione) Agitare per 30 minuti, filtrare con filtro a pieghe e poi ottenere almeno 50 ml di liquido filtrato ed estratto

Il procedimento: purificazione Collegare il rubinetto di nylon al gambo corto della cartuccia florisil, lavare quest’ultima e prelevare 10 ml di CHCl3 con la siringa e farne passare 8 nella cartuccia attraverso il rubinetto, per togliere l’aria Collegare il gambo lungo della cartuccia alla colonna di vetro e far passare gli altri 2 ml di CHCl3, attraverso la cartuccia, nella colonna; poi chiudere il rubinetto e staccare la siringa Aggiungere il filtrato al complesso colonna-cartuccia e lasciare filtrare per gravità, poi lavare con 5 ml di CHCl3 e poi con 20 ml di MeOH; poi scartare i componenti dell’eluito (attenzione: nel frattempo controllare che la colonna-cartuccia non vada a secchezza)

Il procedimento: purificazione Eluire le AF con 40 ml di acetonelacqua e raccogliere l’eluato che si ottiene Utilizzando il rotavapor, concentrare l’eluato, anche per eliminare i residui di acetone rimasti che porterebbero a perdita di analita (le AF) nella cartuccia C18; riprendere questo residuo con 1 ml di MeOH e 4 di acqua Collegare il rubinetto al gambo corto della cartuccia di C18 e far passare con la siringa 10 ml di MeOH, per togliere l’aria; prelevare 10 ml di acqua e farne passare 8 attraverso la cartuccia

Il procedimento: purificazione Collegare il gambo lungo della cartuccia a una colonna di vetro e far passare, attraverso la cartuccia, gli altri 2 ml di acqua, nella colonna; poi chiudere il rubinetto e staccare la siringa Mettere l’estratto ottenuto nella colonna e, con acqualmetanolo, lavare il pallone almeno 2 volte; lasciare filtrare per gravità; controllare che la colonna-cartuccia non vada a secchezza Eluire le AF con 50 ml di acqualacetone; raccogliere, in un cilindro graduato, tutto l’eluato; se ritenuto necessario, portare a volume 50 ml con acqua e mescolare.

Il procedimento: determinazione HPLC Impostare il flusso della pompa a 0,5/0,3 ml/min, rispettiv. per colonna da 5 o da 311 u; la fase mobile (eluente) è acqualmetanolo /acetonitrile Il flusso dell’altra pompa dev’essere impostato a 0,4/0,2 ml/min di soluzione satura di iodio per flussi rispettiv. di 0,5 e 0,3 ml/min dell’eluente Il rivelatore a fluorescenza va impostato alle λ di lavoro; regolare il detector impostando una deviazione di circa l’80% del fondo scala del registratore per 1 ng di AFB1

Il procedimento: determinazione HPLC Introdurre per iniezione nello strumento 250 μl delle soluz. Di calibrazione, precedentemente preparate, e dell’estratto del campione Verificare la linearità della risposta fluorimetrica calcolando la curva di regressione lineare y=ax+b che si ottiene dalla correlazione della quantità x delle AF in ng iniettate, con le aree proporzionali all’intensità di fluorescenza y

Calcoli II contenuto delle aflatossine totali del campione, in μg/Kg, è calcolato con questa formula: AF = (m ∙ Vn) / (Vm ∙ M ∙ Vf ∙ 250) Dove: m = quantità di AF (espressa in ng) che si ottiene dal picco del campione estratto, e che si calcola sulla curva di regress. lineare Vn = i ml di estratto di campione che sono stati iniettati Vm = il ml finali dell'estratto di campione M = la massa (g) del campione Vf = il volume (ml) del filtrato ottenuto 250 = i ml di CHCl3 usato per estrarre il campione Se l’analisi e stata effettuata secondo le indicazioni la formula diventa: AF (espressa in μg/kg) = 20 ∙ m

Fonti ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’, Metodi di analisi utilizzati per il controllo chimico degli alimenti, raccolta a cura di Massimo Baldini, Fabio Fabietti, Stefania Giammarioli, Roberta Onori, Leucio Orefice e Angelo Stacchini, 1996, v, 265 p. Rapporti ISTISAN 96/34 RICERCA SULLE CARATTERISTICHE DI FILTRABILITA’ DELLA BIRRA E OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO DI FILTRAZIONE, tesi Presentata da: MICHELE SENSIDONI, Università di Bologna http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:364:0005:0024:IT:PDF http://www.confindustria.tn.it/confindustria%5Ctrento%5Cnews.nsf/web/42904D24BD27A724C125774A004E1205/$File/Decreto%20Legislativo%2010%20maggio%202004%20n.%20149.pdf?OpenElement