Mercoledi 17 Novembre Mercoledi 24 Novembre Aula GOLGI Ore 15, ,00 Esercitazioni di Biochimica

Regolazione dell’Espressione Genica Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi: DNA RNA transcript mRNA inactive mRNA protein inactive protein NUCLEUSCYTOSOL trascrizioneMaturazionetrasporto traduzione degradazione controllo dell’attivita’

ErythrocytesWhite blood cells Molecular mass kDa pH Different cell types contain different proteins Molecular mass kDa Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Hb  Hb 

Perche’ l’emoglobina e’ presente ad alti livelli negli eritrociti e assente nei globuli bianchi ? Hb  e Hb  sono I polipeptidi che insieme all’eme formano l’emoglobina dell’adulto Concentriamoci sulla  -globina. Se la regolazione coinvolge la sua sintesi allora dovremo studiare le cellule che la producono, gli eritroblasti. Differenziamento degli eritrociti

Il differenziamento delle cellule del sangue nel midollo spinale Myeloid stem cells (Precursor cells) Erythroblasts (Fanno l’emoglobina) White blood cells except lymphocytes (non contengono emoglobina) Erythrocytes (contengono l’emoglobina)

Regulation of  globin synthesis White blood cellsErythroblasts DNA  globin mRNA  globin Protein Gene presente Proteina quasi completamente assente Proteina presente ??

Regulation of  globin synthesis White blood cellsErythroblasts DNA  globin mRNA Globin Protein Gene presente Proteina quasi completamente assente Proteina presente Quasi assente presente in grandi Quantita’

Meccanismi che Potrebbero portare ad un aumento dell’mRNA di Hb negli eritrociti  globin mRNA e’ trascritto negli eritrociti e nei globuli bianchi ma in questi ultimi : Non e’ processato e poi e’ degradato Processato ma rapidamente degradato  globin mRNA e’ trascritto negli eritrociti ma non nei globuli bianchi Un modo di misurare SOLO la velocita’ di trascrizione e’ : RUN-OFF TRANSCRIPTION

Nucei ISOLATI, continuano a sintetizzare l’RNA (run- off RNA), ma non iniziano nuove molecole di RNA I nuclei sono incubati con ATP radioattivo. I run-off RNA sono isolati, separati e identificati. Un forte segnale significa che al momento dell’isolamento dei nuclei la cellula stava producendo molto RNA. Run-off transcription

5’ Nessun nuovo inizio Run-off transcription in vitro precursori Radioactivi Result of hybridisation

 globin Run-off transcripts from Eritroblasti Run-off transcripts from Gobuli Bianchi Positive control, actin Positive control, actin globin filter

L’esperimento ci dice : Negli eritroblasti il gene della globina e’ trascritto molto velocemente Nei globuli bianchi la sua velocita’ di trascrizione e’ bassissima  globin Quindi la globina e’ presente solo negli eritroblasti perche’ qualche cosa influenza la trascrizione del suo gene.

Controllo del livello di ferro nella cellula Il ferro e’ un nutriente essenziale La cellula lo usa per : citocromi, emoglobina e molti enzimi. Il ferro in eccesso e’ causa di formazione di radicali liberi Quindi il livello di ferro deve essere controllato accuratamente.

Fe 2+ Sangue Fe 3+ Transferrin (trasporto) Transferrin receptor (ingresso) Ferritin (Stoccaggio) Regolazione di proteine trasportatrici/immagazzinamento del ferro Quando il ferro e’ in eccesso la cellula deve diminuire il livello del recettore e aumentare quello della ferritina. La cellula ottiene questo mediante regolazione della traduzione, Cosi la risposta e’ piu’ rapida

Controllo della Traduzione 1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina 2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina Ferritina - Lega il Ferro e lo conserva Recettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFR Se non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina Come viene regolato tutto questo?

M Coding region AUG Fe m7Gm7G Iron Response Element IRE-BP (cytosolic aconitase) Fe M Ferritin mRNA Coding region AUG 1. Repressione :-Ferro, ferritina NO 2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI M

Coding region AUG m7Gm7G Iron Response Element IRE-BP (cytosolic aconitase) Fe M TFR mRNA Coding region AUG 1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO

Coding region AUG m7Gm7G Iron Response Element IRE-BP (cytosolic aconitase) TFR mRNA Coding region AUG 1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO Fe RNAse

Il ferro previene il legame di una proteina di 90 kDa ad uno o piu’ Iron Response Elements. Recettore della Transferrina. Stem loop al 3’. La presenza dello stem loop causa la degradazione dell’mRNA Ferritina Stem loop al 5’. La presenza della proteina sullo stem loop causa il blocco della traduzione.

Purificazione degli Intermedi della traduzione

CICLOEXIMMIDE: interferisce con La reazione della peptidil transferasi (arresto dei ribosomi 80S sull’AUG) GMP-PNP (Analogo del GTP pero’ Non-idrolizzabile): GTP richiesto per L’unione della subunita’ 60S al complesso 40S/mRNA CAP analogo:inibisce il legame della 40S all’mRNA

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

WT-IRE: IRE come e’ nella Ferritina  C-IRE: IRE con una delezione

Componenti del Complesso Che lega il CAP NOTA BENE: all’inizio della traduzione il legame della 40S all’mRNA richiede Il legame del “CAP binding Complex” al cappuccio dell’mRNA

NOTA: Il legame della 40S al CAP dell’mRNA richiede l’interazione di elF3 (che e’ legato Alla 40S) con elF4 (legato al CAP)

Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH- + OH°

La presenza di acqua ossigenata o ossido nitrico rende attiva IRP-1 (che e’ la IRE binding Protein piu’ abbondante) che quindi causa un aumento del recettore della transferrina Il ferro viene rimosso dal sangue e non genera radicali liberi!

DMT1 DMT2 Quindi DMT1 e’ l’unico regolabile dal Ferro

DMT2 DMT1 Se non e’ presente abbastanza Fe Nella cellula del Duodeno viene Indotta la sintesi di DMT1