Laurea Magistrale in Biotecnologie ambientali ed industriali Coltivazione di microalghe per la produzione di lipidi e carboidrati: utilizzo di reflui oleari Candidata: Iryna Boika Relatore: Prof.ssa Francesca Pagnanelli Facoltà di scienze fisiche, matematiche e naturali

Microrganismi fotosintetici Microalghe Microrganismi fotosintetici 35.000 specie descritte (elevata biodiversità) Specie eucariotiche e procariotiche Unicellulari (possono tuttavia crescere in colonie) Presenti sia in acqua dolce che in acqua salata Dimensioni generalmente tra 2 e 40 µm

Metabolismo algale Metabolismo Metabolismo eterotrofico autotrofico fosfati Glucosio Glicerolo Acetato nitrati Metabolismo mixotrofico

Metabolismo Accumulo di lipidi in Scenedesmus sp. durante diversi giorni di N-starvation

biomassa Produzione di biocarburanti e fine chemical da microalghe Biodiesel Lipidi Bioetanolo biomassa Biometano Proteine Integratori per mangimi Integratori nutraceutici Carboidrati Polimeri

Scopo della tesi Ottimizzazione delle tecniche di coltivazione delle microalghe al fine di superare le problematiche che ne limitano la competitività Aumento produzione biomassa nelle condizioni mixotrofiche/eterotrofiche Sviluppo processi integrati l’utilizzo di acqua di rete e di acque di vegetazione di frantoi oleari (AVO) nella formulazione del mezzo colturale per la crescita di microalghe. Riduzione costi di impianto codepurazione reflui Ottimizzazione parametri operativi Pretrattamento di AVO; Concentrazione azoto e micronutrienti; Strategie di alimentazione dell’AVO Analisi dell’effetto di diversi fattori su crescita algale, composizione della biomassa e riduzione del carico inquinante del refluo

Progetto Alghe Energetiche Selezione del ceppo Ceppo di Scenedesmus sp. selezionato nelle fasi di avviamento dell’impianto pilota nel progetto Alghe Energetiche Unico ceppo, tra quelli testati, in grado di crescere nelle condizioni di impianto Progetto Alghe Energetiche

Sviluppo processo integrato Acqua di vegetazione dei frantoi oleari (AVO) scelta come refluo Composizione AVO   Parametro Valore ± Δ Fenoli (g∙l-1) 4.88 0.05 Zuccheri riducenti (g∙l-1) 8.6 0.3 Solidi sospesi (ml∙l-1) 240 20 Solidi totali (g∙l-1) 51.1 0.2 Residuo secco 105 ° (%) 5.11 0.02 H2O (%) 94.89 COD (g∙l-1) 49 5 pH 5.0 PO43- (mg∙l-1) 1347 1 Densità (g∙ml-1) 1.02 0.01 Ferro (mg∙l-1) 10 C (%) 40 H (%) N (%) 1.0 0.8 S (%) 0.9 Produzione stimata in Italia: 2 milioni di t/anno Difficoltà di smaltimento per l’elevato carico organico e l’elevata presenza di fenoli (azione antimicrobica e fitotossica, biodegradabilità limitata) Scenedesmus sp. è in grado di degradare i fenoli

Valutazione effetto del pretrattamento di AVO con i carboni attivi Conc. di nitrati 1100 mg/L Riduzione Zuccheri 55% Fenoli 90% Lipidi: 33 ±3 % Carboidrati: 21 ±2%

Valutazione effetto della concentrazione dei nitrati 1,6 g/L 1,3 g/L Aumento significativo di carboidrati dal 20±2% al 36±1%

Aumento dei carboidrati nelle alghe coltivate in MS Valutazione effetto aggiunta AVO (9%) e uso del mezzo preparato da acqua di rete Aumento dei carboidrati dal 34 % al 43 % nelle alghe coltivate in MS dal 21% al 44% nelle alghe coltivate in AR MS = mezzo standard BG 11 AR = mezzo da acqua di rete

Valutazione dell’effetto di diverse strategie di alimentazione con AVO Aggiunta AVO Rimozione Zuccheri in AVO: “Iniziale” 74±4 % “graduale” 62,7±0,3 % “finale” 13±3% Aumento di carboidrati nella biomassa da 21 a 32 %

Valutazione dell’effetto di EDTA e micronutrienti Lipidi: 23 % Carboidrati: 23% Lipidi: 25 % Carboidrati: 36 % Rimozione a 17 gg zuccheri: 61±4 % Rimozione a fine test Fenoli: 64± 7% COD: 67±9 % zuccheri: 71±5 %

Valutazione effetto di diverse strategie di alimentazione di AVO sulla produttività di lipidi e carboidrati

Scelta strategia migliore “Graduale” Riduzione produttività Rimozione 14 gg “graduale” Fenoli - 24±2% Carboidrati - 60±4% Rimozione fine test “graduale” Fenoli – 70±1% Carboidrati - 60±4% Max produttività Biomassa 57,4±0,3 mg/L/d lipidi 30±2 mg/L/d Carboidrati 37±2 mg/L/d Riduzione produttività Biomassa 42±2 mg/L/d lipidi 7,7±0,2 mg/L/d carboidrati 12,06±0,08 mg/L/d

Conclusioni Razionalizzazione dei costi dell’impianto L’utilizzo di acqua di rete e AVO non trattata nella formulazione del mezzo colturale per la crescita di Scenedesmus sp.; riduzione della concentrazione di nitrati a 250 mg/L. composti tossici presenti in AVO determinano una riduzione della produttività della biomassa a 20±5 mg/L/d rispetto a 50,8±0,1 mg/L/d senza aggiunta di AVO; tuttavia il contenuto di carboidrati nella biomassa raddoppia 44±4% rispetto al 24,4±0,8% senza aggiunta di AVO. Le Strategie “graduale” e “finale” permetono di ridurre il carico tossico di AVO per unità di cellula mantenendo il contenuto di lipidi/carboidrati elevato La produttività di biomassa a 13 gg di coltivazione 63,7±0,7 mg/L/d per il trattamento “graduale” 77,8±0,7 mg/L/d per il trattamento “finale” 31,9±12 mg/L/d per il trattamento “iniziale” il contenuto lipidico (30±7%) e dei carboidrati (32±3%). La strategia “graduale” ha dato i risultati più promettenti dopo 14 giorni di coltivazione: produttività di biomassa (57,4±0,3 mg/L/d), di lipidi (30±2 mg/L/d) e di carboidrati (37±2 mg/L/d) una riduzione significativa del carico organico presente in AVO (60±4% della concentrazione totale di zuccheri e 24±2% di quella di fenoli). Riduzione ulteriore della quantità di composti polifenolici richiede i tempi di coltivazione più lunghi e comporta una diminuzione rilevante della produttività di carboidrati (12,06±0,08 mg/L/d) e lipidi (7,7±0,2 mg/L/d). Razionalizzazione dei costi dell’impianto per coltivazione di Scenedesmus sp. Alta produttività di biomassa 57,4±0,3 mg/L/d, di lipidi 30±2 mg/L/d di carboidrati 30±2 mg/L/d codepurazione del refluo riduzione zuccheri 60±4% riduzione fenoli 24±2% Dopo 14 giorni Strategia “graduale”

Grazie per l’attenzione