La Proteomica nelle Malattie Renali Università degli Studi “G. d’Annunzio” Chieti - Pescara La Proteomica nelle Malattie Renali Mario Bonomini Cattedra e Clinica Nefrologica Ospedale Clinicizzato SS. Annunziata, Chieti

PROTEOMICA La proteomica è la Scienza Omica che studia il proteoma (insieme di PROTEine espresse dal genOMA). Essa comprende una serie di tecniche che permettono identificazione, quantificazione e caratterizzazione di un set globale di proteine e peptidi presenti in un campione biologico. L’approccio proteomico alla identificazione delle proteine non richiede ipotesi a priori circa quali proteine possano essere presenti e permette la simultanea analisi di tutte le proteine presenti anche in miscele complesse. L’analisi proteomica consente anche di evidenziare singole isoforme proteiche e modificazioni proteiche post-traslazionali.

Proteomic technologies are being used with increasing frequency in the renal community. Proteomic studies are most directed at finding markers of disease progression, diagnosis, or responsiveness to therapy.

Ambiti di applicazione della Proteomica in Nefrologia Fisio(pato)logia renale Nefropatie glomerulari CKD AKI Nefrolitiasi Uropatia ostruttiva Trapianto renale Emodialisi Dialisi peritoneale Tossicità uremica Tossicità farmacologica

PROTEOMICA TISSUTALE L’analisi proteomica del tessuto renale può essere impiegata per identificare quali proteine sono presenti, per confrontare l’abbondanza proteica tra zone tissutali o condizioni, e per analizzare modificazioni post-traslazionali.

Database http://www.hkupp.org Kidney   Glomerulus    2DGE-LC-Based Proteomics    2DGE-Based Proteomics   Proximal Tubule   Distal Tubule   Collecting Duct     Rat IMCD     Rat IMCD Phosphoprotein   Others    Transcriptomics & Proteomics http://www.hkupp.org

NEJM 2009

2011 2013

PROTEOMICA URINARIA Mappa urina soggetto normale non linear pH 3.0 3.0 non linear pH 10.0 10.0 Mappa urina soggetto normale Cortesia G. Candiano, Ospedale Gaslini, Genova

Dimostrata superiorità del modello vs. creatininemia Naturally Occurring Human Urinary Peptides for Use in Diagnosis of Chronic Kidney Disease Studio mediante elettroforesi capillare+spettrometria di massa di campioni urine di 230 pazienti con CKD e 379 soggetti sani Identificazione di 273 potenziali biomarcatori associati a CKD e creazione di un modello di classificazione basato su tali markers (frammenti di collagene, proteine ematiche, proteine rene-specifiche) Successiva validazione “in cieco” del modello in 110 pazienti affetti da CKD Dimostrata superiorità del modello vs. creatininemia Peptide patterns distinguishing patients with CKD from Healthy Controls Good et al, Molecular & Cellular Proteomics, 2010

Source proteins and peptide distribution of CKD biomarkers www.humanproteinpedia.org; accession number HuPA_00670

Urinary Proteomics in Diabetes and CKD “A panel including 65 urinary biomarkers correctly identified diabetic nephropathy from diabetes without compromized renal function (97% sensitivity and specificity), and patients who were microalbuminuric at sampling and progressed toward overt diabetic nephropathy over 3 years. ….Many of the biomarkers were fragments of collagen type I, and quantities were reduced in patients with diabetes or diabetic nephropathy. ….Analysis of the urinary proteome may allow early detection of diabetic nephropathy and may provide prognostic information.” Rossing et al, JASN 2008

RILEVANZA FISIOPATOLOGICA DEI BIOMARCATORI URINARI PROTEOMICI DI CKD I frammenti del collagene urinari, riflettendo il fisiologico turnover della matrice extracellulare, non sono semplici prodotti di degradazione; essi possono essere indicativi di processi fisiopatologici e fornire informazioni malattia-specifiche in un singolo test diagnostico CKD ↓ degradazione matrice extracellulare ↑ fibre collagene insolubili ↑ matrice extracellulare e alterazioni strutturali perdita di funzione e fibrosi

RILEVANZA FISIOPATOLOGICA DEI BIOMARCATORI URINARI PROTEOMICI DI CKD Alterazioni della matrice extracellulare riflesse attraverso il proteoma urinario, possono rappresentare uno stadio precoce nel processo patologico della CKD e antagonizzare il patologico accumulo di matrice extracellulare può rappresentare un nuovo valido approccio terapeutico. Mullen et al, Curr Opin Nephrol Hypertens 2011

22 pazienti nefropatici con diabete tipo 2 Irbesartan 300 mg/die (n=11) Placebo (n=11) Basal 2 years Basal 2 years

STUDI CLINICI IN CORSO CON STRATIFICAZIONE DEI PAZIENTI IN BASE AD ANALISI DI PROTEOMICA URINARIA Mischak H and Rossing P, Nephrol Dial Transplant 2010

Kidney International (2010) 78, 1252–1262 ICU TRAINING SET 30 pazienti ricoverati in ICU con FR normale, con raccolta longitudinale di campioni urinari 16/30 successivo sviluppo di AKI (↑ creatininemia) Caratterizzazione e confronto del pattern peptidico urinario (elettroforesi capillare+spettrometria di massa) dei pazienti con AKI vs pazienti che hanno mantenuto FR normale Sensibilità 92%, specificità 90%

Validazione risultati ICU training set ICU VALIDATION SET Studio di coorte di fase II, prospettico, in cieco 20 pazienti in ICU Il pattern peptidico urinario ha correttamente identificato 8/9 pazienti che hanno sviluppato AKI ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION VALIDATION SET 31 pazienti con trapianto (quale differente eziologia di AKI) In 13 sviluppo di AKI (sensibilità pattern peptidico urinario 94%, specificità 82)

Up Regulation Down Regulation Caratteristiche dei polipeptidi urinari inclusi nel pattern di marcatori AKI Mass (Da) CE time (min) Protein Remarks 1439.66 29.82 a-1 antitrypsin 912.54 20.06 2080.99 20.20 Albumin 2356.16 19.52 2427.19 19.58 2540.28 19.68 2639.35 19.78 1081.66 20.73 b-2 Microglobulin 1399.59 28.53 2603.30 20.07 2716.38 20.19 1654.79 23.13 Collagen 1 a(I) 1737.78 31.00 1250.55 27.93 3359.57 31.90 2942.30 22.23 2007.94 22.10 Collagen 1 a(III) 1825.78 19.41 Fibrinogen a chain 1882.80 20.14 2559.18 Up Regulation Ridurre dimensioni x inserire titolo: Caratteristiche dei polipeptidi urinari inclusi nel pattern di marcatori AKI Sistemare meglio le scritte dei remarks Colorare le colonne (colore diverso x la colonna Protein) Down Regulation

Efficacia diagnostica precoce del pattern AKI urinario

Diagnosis of subclinical and clinical acute T-cell-mediated rejection in renal transplant patients by urinary proteome analysis sviluppo di un modello di identificazione di rigetto acuto, basato su 14 biomarcatori urinari validazione in cieco del modello: corretta diagnosi in 16/18 casi di rigetto subclinico e in 10/10 casi di rigetto clinico (gradi Banff Ia/Ib) Il modello è attualmente impiegato in uno studio multicentrico di fase III in corso in Germania Metzger et al, Proteomics Clin Appl 2011

Limitazioni ad un diffuso impiego clinico della Proteomica in Nefrologia Carenza di protocolli condivisi su raccolta e analisi campione biologico Studi di ridotte dimensioni campionarie Costi Necessità di personale tecnico specializzato

Iniziative volte a favorire l’applicabilità clinica della Proteomica in Nefrologia Standardizzazione metodi di raccolta e preparazione del campione biologico Disponibilità di ampi e aggiornati database

Database di Proteomica Urinaria Umana Siwy et al, Proteomics Clin Appl 2011

Iniziative volte a favorire l’applicabilità clinica della Proteomica in Nefrologia Standardizzazione metodi di raccolta e preparazione del campione biologico Disponibilità di ampi e aggiornati database Studi multicentrici di validazione Studi con più adeguati disegni e dimensioni Attività collaborative nazionali e internazionali

Gruppo di Studio SIN Scienze Omiche Società Italiana di proteomica It-HPP Mithocondria Initiative by the Italian Proteomics Association on a Mitochondria Integrated Biology Program, on Chronic Not Transmissible Diseases. Approved by the Human Proteome Project Consortium (September 2012) International partner ISNAFF (www.isnaff.org) for Canada and USA, IFCC, cQQP commission, EU JPND, Other National Societies SIN (ItPA GC, June 13th, 2012) SIRNA (Rome, Nov 2012)

CONCLUSIONI In Nefrologia vi è stringente necessità di migliori markers diagnostici e terapeutici. La Proteomica ha dimostrato in ambito nefrologico capacità di identificazione di nuovi set di biomarcatori, indicativi di progressione, diagnosi o risposta al trattamento. La traducibilità clinica degli studi di Proteomica, iniziale e promettente (pur se a lento ritmo di crescita), presenta alcune limitazioni che ne hanno precluso un’ampia diffusione. Le migliorate tecnologie e le attività in corso lasciano ragionevolmente ritenere un prossimo uso della Proteomica nella pratica clinica, più diffuso ed efficace.