AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA “REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)”

PCR: reazione polimerasica a catena Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993) Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte

ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE: 1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE 2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE 3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C) 4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO 2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

PCR: Reazione a catena della polimerasi Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: amplificazione n.ro cicli 1 3 10 15 20 25 30 n.ro sequenze bersaglio 2 256 8192 262.144 8.388.608 268.435.456 La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni. In 1  g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA. Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8  g in 25 cicli e 27  g in 30 cicli.

PCR VANTAGGI: Sensibilita’ Rapidita’ Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput) Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato SVANTAGGI: Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi) Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers) Può sintetizzare frammenti relativamente corti La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

Esempi di utilizzo della PCR Su DNA: segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare” Su RNA messaggero (RT-PCR): segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi) Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare” - isolare cDNA specifici per determinati geni.

PCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme

PCR/VNTR/STR in genetica forense Quale delle persone sospette può avere commesso il crimine? La tecnica PCR è utile, spesso necessaria, per amplificare il DNA estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli.

Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione allele-specifica

Diagnosi genetica pre-impianto

PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA: PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR) Estrazione dell’RNA Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA) Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa AAAAAAAA 3’ 5’ TTTTTTTT 5’ 3’ mRNA cDNA

PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA: PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR) cDNA 3’ TTTTTTTT 5’ AAAAAAAA 3’ 5’ mRNA Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesco specifici TTTTTTTT 5’ 3’ 5’ AAAAAAAA 3’ 5’ 3’ Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)

La PCR non e’ una tecnica quantitativa Number of molecules Number of cycles

PCR quantitativa: RT-PCR in tempo reale Utilizza particolari sostanze la cui fluorescenza si rivela quando intercalano la catena di DNA sintetizzata durante la reazione di amplificazione. L’utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza

Polymerase Chain Reaction: resa Resa teorica: 2n P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n) Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza Log[DNA] N° cicli termici Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile

Polymerase Chain Reaction: plateau Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

Soluzioni Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale Il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

Manual or automated analysis RT-PCR convenzionale Real-time RT-PCR Reverse transcription Reverse transcription PCR reaction Nested PCR reaction Gel electrophoresis DNA sequencing Southern blot PCR reaction Quantitative result Manual or automated analysis

Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

RT-PCR quantitativa Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

Analisi tramite software

Chimiche fluorescenti per PCR Real-Time La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

SYBR Green

SYBR Green: principio SYBR Green I Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

SYBR Green All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente

SYBR Green Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

SYBR Green Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone

SYBR green Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Non-specifica La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici