Atomi: massa atomica e isotopi Bio-MS lezione 1

Isotopi Bio-MS lezione 1

Massa: definizioni Massa media Massa della molecola basata sulla somma delle masse atomiche medie degli atomi costituenti la molecola stessa. Massa esatta Viene calcolata prendendo in considerazione non le masse medie degli atomi, ma le masse del loro isotopo principale. Bio-MS lezione 1

Spettrometria di massa La spettrometria di massa e’ una tecnica che consente di misurare il peso di atomi o molecole. La determinazione della massa, o del peso molecolare e’ sempre utile per individuare l’identita’ di una sostanza. Per effettuare questa analisi bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie degli ioni risultanti rispondano nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici. Per piccole specie molecolari, la ionizzazione e’ facilmente ottenibile bombardando l’analita con un fascio di elettroni. Negli ultimi anni, gli sforzi di molti ricercatori hanno portato alla scoperta di nuove tecniche di ionizzazione in grado di caricare elettricamente molecole estremamente grandi, altrimenti impossibili da ionizzare con metodi tradizionali senza ottenere una totale distruzione del campione John Fenn, Premio Nobel per la chimica 2002 Bio-MS lezione 1

Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro rapporto massa/carica Spettrometria di massa Per effettuare un’analisi mediante spettrometria di massa bisogna impartire una carica elettrica alla molecola di interesse, cioe’ l’analita, e successivamente misurare come le traiettorie dello ione risultante rispondono nel vuoto a varie combinazioni di campi elettrici e magnetici. Le traiettorie degli ioni dipendono dal loro rapporto massa/carica m/z Bio-MS lezione 1

Lo spettrometro di massa: un prisma molecolare Generazione di ioni Separazione delle componenti Rilevamento delle componenti separate Bio-MS lezione 1

Spettro di massa 77 156 158 51 ? Bio-MS lezione 1

Spettri EI: esempi 77 156 158 51 Bromobenzene Bio-MS lezione 1

Camera di ionizzazione Componenti di uno spettrometro di massa Camera di ionizzazione EI, MALDI, ESI Analizzatore a tempo di volo(TOF), quadrupolo (Q) Analizzatore Fotomoltiplicatore, elettromoltiplicatore Rivelatore Bio-MS lezione 1

Costruito il primo spettrometro di massa Ionizzazione Condizione necessaria all’analisi spettrometrica e’ la generazione di specie cariche in fase gassosa. Tale processo e’ detto ionizzazione. Il processo richiede energia Costruito il primo spettrometro di massa ESI MALDI 1907 1966 1984 1985 CI EI 1900 1925 1950 1975 2000 Bio-MS lezione 1

Metodi di ionizzazione (1) Protonazione Proteine, peptidi, ammine + NH3 M + H+  [M+H]+ Deprotonazione Oligonucleotidi, acidi carbossilici O M - H+  [M-H]- - O Bio-MS lezione 1

Piccole molecole organiche Metodi di ionizzazione (2) OH Addizione cationica Carboidrati M + Na+  [M+Na]+ Na+ OH Espulsione di elettroni +. Piccole molecole organiche - e- CH3 M  M+. Bio-MS lezione 1

Metodi di ionizzazione a confronto Pro Contro Applicabile a molti composti Ottenibile attraverso diversi metodi di ionizzazione (ESI, MALDI, FAB, APCI) Non applicabile nell’ analisi di carboidrati Non applicabile nell’analisi di idrocarburi [M+H]+ Maggiore specificita’ e sensibilita’ rispetto alla protonazione Utile nell’analisi di molecole acide tramite FAB, ESI, MALDI, APCI [M-H]- Non universale quanto la protonazione Applicabile all’analisi di carboidrati e molti tipi di polimeri sintetici Ottenibile attraverso diversi metodi di ionizzazione (ESI, MALDI, FAB, APCI) Difficile ottenere informazioni strutturali da molecole ionizzate mediante addizione cationica [M+Na]+ Puo’ contemporaneamente fornire ionizzazione della molecola di interesse + frammentazione della stessa Vasta applicabilita’ nel caso di molecole volatili. Ottenibile mediante EI [M-e-]+ Spesso genera frammentazione troppo estesa Non applicabile a biomolecole Bio-MS lezione 1

Come scegliere la modalità di ionizzazione? Individuare la modalità di ionizzazione più appropriata per l’analisi di un determinato composto è una procedura che si basa essenzialmente su tre fattori Osservazione delle proprietà chimiche della molecola (e.g. proprietà acido-base, presenza di gruppi funzionali, volatilità, etc.) Esperienza (confronto con molecole analizzate con successo nel passato o con dati di letteratura). Verifica pratica (confronto sperimentale tra due o più tecniche di ionizzazione ritenute potenzialmente le più efficaci nella ionizzazione dell’analita in questione). Bio-MS lezione 1

Principali tecniche di ionizzazione Ionizzazione “hard” EI (electron impact) Ionizzazioni “soft” MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation) ESI (electrospray ionization) APCI (atmospheric pressure chemical ionization) Bio-MS lezione 1

EI: Ionizzazione per impatto elettronico Filamento di tungsteno Funziona su specie volatili, gia’ presenti allo stato gassoso all’atto della ionizzazione Genera ioni ad alta energia, i quali spesso frammentano molto velocemente in seguito alla ionizzazione Adatta alla ionizzazione di piccole molecole ( < 400 Da) M M Repulsore M+. M+. M+. M+. M M All’analizzatore Fascio di elettroni ad alta energia Bio-MS lezione 1

EI: Ionizzazione per impatto elettronico EI produce ioni ad alta energia. L’elevata energia interna causa una facile frammentazione dello ione molecolare. I frammenti sono rivelati dallo spettrometro di massa. Essi sono comunque utili per caratterizzazione strutturale (identificazione). Intensita’ Bio-MS lezione 1 m/z

EI: Ionizzazione per impatto elettronico Gli ioni molecolari generati da EI possiedono un’elevata energia (in genere, vengono utilizzati 70 eV). - e- . Ione molecolare M  M+ . . M+  A+ + R La frammentazione dello ione molecolare è un processo spontaneo che avviene per l’eccesso di energia interna dello ione stesso. La frammentazione è determinata dalla struttura molecolare. . M+.  A+ + N Bio-MS lezione 1

Frammentazione EI: rottura omolitica .. .. .. .. Bio-MS lezione 1

Frammentazione EI: rottura eterolitica . -X . R-X+  R+ +. Bio-MS lezione 1

Frammentazione EI: guide generali La frammentazione dello ione molecolare è determinata dalla struttura dello ione stesso (e, di conseguenza, della molecola originaria). In particolare, gli ioni molecolari tendono a: Frammentare in modo da produrre frammenti a bassa energia, quindi relativamente stabili (ad esempio, stabilizzati per risonanza). Liberare piccole molecole neutre (neutral loss) ad elevata stabilità (acqua, idrogeno, acetilene, monossido di carbonio, etc.) Bio-MS lezione 1

Spettri EI: esempi 105 77 136 51 Benzoato di metile Bio-MS lezione 1

Spettri EI: esempi 88 59 57 29 87 43 41 27 74 71 59 15 Bio-MS lezione 1

Riarrangiamento di Mc Lafferty Frammentazione EI: riarrangiamento di McLafferty Riarrangiamento di Mc Lafferty 87 43 41 27 74 71 59 15 Bio-MS lezione 1

Spettri EI Gli spettri di massa generati da ionizzazione EI sono altamente riproducibili. E’ stato quindi possibile generare banche dati di spettri EI ottenuti sperimentalmente da decine di migliaia di composti organici. L’identificazione di un composto incognito in un campione, quindi, molto spesso si riduce ad una semplice ricerca in banca dati dello spettro EI ottenuto sperimentalmente. Bio-MS lezione 1

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization La tecnica e’ basata su un’analisi in fase solida, anche se il campione di partenza e’ in genere in soluzione. L’energia necessaria alla ionizzazione del campione e’ fornita sotto forma di radiazione elettromagnetica. La radiazione e’ inviata in pacchetti ad alta intensita’ tramite un impulso laser Bio-MS lezione 1

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization HO HO Matrice COOH COOH OH H CN DHB CHCA Acido 2,5-diidrossi benzoico Acido α-cian-4- idrossicinnamico Campione (proteina,peptide, acido nucleico, zucchero) Laser ad azoto, emissione a 337 nm (UV) Bio-MS lezione 1

MALDI- preparazione del campione Soluzione di matrice Soluzione campione Miscelare (la matrice e’ in forte eccesso) Depositare sulla piastra metallica (1 μL) Piastra metallica Piastra metallica per la deposizione del campione e l’analisi Lasciare cristallizzare Piastra metallica Bio-MS lezione 1

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization + 20 kV Impulso laser + + + + All’analizzatore + + + Piastra metallica + + + + Matrice + Proteina Bio-MS lezione 1

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - 20 kV Impulso laser - - - - All’analizzatore - - - Piastra metallica - - - - Matrice - DNA/RNA Bio-MS lezione 1

MALDI: meccanismo di ionizzazione Il processo di ionizzazione MALDI sembra non essere basato su un singolo meccanismo. A seconda delle condizioni sperimentali, possono avvenire differenti processi di ionizzazione. La esistenza di ioni pre-esistenti nei cristalli di matrice è stata dimostrata sperimentalmente. La sublimazione della matrice con conseguente liberazione in fase gassosa degli ioni pre-formati è una delle vie di ionizzazione del MALDI. Il trasferimento di protoni dalla matrice all’analita negli istanti immediatamente successivi al desorbimento è ritenuto un altro meccanismo responsabile della ionizzazione di analiti basici. Nel caso di sostanze capaci di assorbire la luce UV, è anche possibile la fotoionizzazione diretta del campione, con la formazione di ioni radicalici (generalmente non di interesse nel caso delle biomolecole). Bio-MS lezione 1

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Genera per lo piu’ specie monocarica Buona tolleranza a contaminanti e sali Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa) 100 20900 10451 % Intensity 6966 10700 20000 24000 m/z Bio-MS lezione 1

MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Genera per lo piu’ specie monocarica Buona tolleranza a contaminanti e Sali Capace di ionizzare proteine (> 300 kDa) [M+H]+ 100 20900 [M+2H]2+ 10451 % Intensity [M+3H]3+ 6966 10700 20000 24000 m/z Bio-MS lezione 1

Elettrospray - ESI La tecnica e’ basata sulla nebulizzazione di una soluzione contenente il campione da analizzare. L’energia di ionizzazione e’ fornita da un campo elettrico generato tra l’ago di introduzione del campione e lo spettrometro di massa. www.newobjective.com Bio-MS lezione 1

Elettrospray - ESI Nessun campo elettrico tra l’ago e lo spettrometro Ionizzazione assente + - + - - + + - MS inlet - Menisco + - + + + + - - + + + - - - + + + Alimentatore Bio-MS lezione 1

Elettrospray - ESI Campo elettrico insufficiente Ionizzazione assente Polo positivo Polo negativo + + 500 V + 50 V - + + - + - - + - + + - + + - MS inlet - + - + + + + + + - + - + + - + + - + + + - - + + + + + + - + + - Modalita’ ionizzazione positiva Alimentatore Bio-MS lezione 1

Si chiude un vero e proprio circuito elettrico Elettrospray - ESI Campo elettrico sufficiente Ionizzazione Polo positivo Polo negativo + + 1000-5000 V + 50 V - + + + + + + + + + + - + - + - + + + - + + + - + + + + + MS inlet - - - + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + - - + + + + + + - + - + + + + + - + + - Si chiude un vero e proprio circuito elettrico Alimentatore Bio-MS lezione 1

Charge residue model (CRM) Ion evaporation model (IEM) Elettrospray - ESI Charge residue model (CRM) Goccia generata da elettrospray + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Progressive droplet shrinkage and droplet fissions + + + + + + + + + + + + + + + + + Ion evaporation model (IEM) Bio-MS lezione 1

Ion evaporation model (IEM) Charge residue model (CRM) Elettrospray - ESI Ion evaporation model (IEM) Evidenze sperimentali hanno dimostrato che IEM è il meccanismo principale attraverso il quale piccole molecole e peptidi vengono ionizzati mediante elettrospray. Charge residue model (CRM) Il meccanismo CRM sembra essere quello prevalente nel consentire la ionizzazione delle macromolecole e dei complessi proteici. Bio-MS lezione 1

Goccia generata da elettrospray L’elettrospray genera ioni multicarica Goccia generata da elettrospray La goccia evapora lungo il tragitto che porta allo spettrometro. + La proteina ionizzata entra nello spettrometro di massa + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + La ionizzazione mediante elettrospray di una soluzione contenente una singola proteina generera’ un segnale multiplo allo spettrometro di massa, dovuto al fenomeno della formazione di ioni multicarica. Bio-MS lezione 1

Ioni multicarica Massa 8000 8002 8003 8004 Carica 0 2 3 4 + + + Massa 8000 8002 8003 8004 Carica 0 2 3 4 m/z 4001 2667 2001 100 M3+ M4+ Intensita’ relativa (%) M2+ m/z Bio-MS lezione 1 5000

ESI di una proteina intatta 996.48 220 909.86 872.01 200 1046.40 951.19 180 805.03 160 140 775.27 1101.28 120 1162.39 Intensity, counts 100 80 747.63 1230.61 60 1307.49 40 1394.65 20 1494.14 1609.01 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z Bio-MS lezione 1

ESI : interleuchina-6 M+n 1230.61 = n M+n+1 1162.39 = n+1 La proteina ha un peso molecolare di circa 21 kDa. La ionizzazione ESI impartisce da 10 a 30 cariche alla molecola 996.48 220 909.86 +20 872.01 200 1046.40 +25 951.19 180 805.03 160 M+n 140 1230.61 = 775.27 1101.28 n 120 1162.39 Intensity, counts 100 M+n+1 80 747.63 1230.61 1162.39 = n+1 60 1307.49 +15 40 1394.65 20 1494.14 1609.01 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z Bio-MS lezione 1

MALDI & ESI: interleuchina 6 100 20900 10451 Mw=20899 MALDI % Intensity 10700 20000 24000 m/z 100 909.86 996.48 872.01 1046.40 951.19 805.03 Mw=20904 775.27 1101.28 % intensity 1162.39 ESI 747.63 1230.61 1307.49 1394.65 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 Bio-MS lezione 1 m/z

ESI: sommario Pro Contro Capace di generare complessi molecolari ionizzati in fase gassosa (very soft) Facilmente interfacciabile con LC Interfacciabile con analizzatori capaci di effettuare MS/MS Nessuna interferenza da parte di matrici Suscettibile alla presenza di sali Miscele complesse possono ridurre la sensibilita’ dell’analisi La presenza di ioni multicarica puo’ confondere, specialmente nel caso di miscele complesse Il campione da analizzare deve essere puro (ma abbiamo spesso LC come introduzione del campione) Bio-MS lezione 1

MALDI: sommario Pro Contro Capace di ionizzare biopolimeri fino a 1 MDa (1,000,000) Piu’ tolleranza nei confronti di sali ed impurezze rispetto all’elettrospray Spettro facile da interpretare. Ioni background sotto i 700 m/z escludono l’applicabilita’ del MALDI a piccole molecole (ma…) Condizioni acide possono causare degradazione del campione (raramente osservate in analisi di peptidi). Bio-MS lezione 1

Ionizzazione chimica CH4 + e- -----> CH4+. + 2e- La ionizzazione chimica (CI) è un processo che può essere sia alternativo all’impatto elettronico per molecole volatili, sia alternativo all’elettrospray come metodo di ionizzazione da fase liquida (in questo caso si parla di APCI). CI rispetto a EI è meno distruttiva, e consente di ionizzare le molecole senza eccessiva frammentazione. CH4 + e- -----> CH4+. + 2e- CH4+. + CH4 -----> CH5+ +CH3. CH4+. + CH4 -----> C2H5+ + H2 + H. M + CH5+ -----> [M+H]+ + CH4 La ionizzazione chimica si ottiene mediante la generazione, all’interno dello spazio dove è stato vaporizzato il campione, di specie cariche in grado di donare protoni all’analita. Un esempio di gas utilizzato è il metano. Per prevenire la ionizzazione diretta dell’analita M, il gas donatore di protoni è presente ad una concentrazione (pressione) molto più elevata dell’analita stesso. Bio-MS lezione 1

APCI La ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) prevede la termonebulizzazione di una soluzione contenente l’analita, seguita dalla ionizzazione chimica mediante il gas di nebulizzazione secondo le reazioni descritte in precedenza (formazione di ioni dal metano o altro gas e reazioni di trasferimento protonico all’analita). Il gas di nebulizzazione è ionizzato inizialmente da una scarica elettrica generata tra il capillare di introduzione del campione e lo spettrometro di massa. Bio-MS lezione 1

Camera di ionizzazione Componenti di uno spettrometro di massa La biomolecola da analizzare viene ionizzata (i) mediante irraggiamento laser della biomolecola stessa dispersa in una matrice cristallina (MALDI); (ii) direttamente da una soluzione, nebulizzandola in presenza di un campo elettrico (ESI). Camera di ionizzazione Gli ioni vengono separati in base al loro rapporto m/z. La separazione puo’ avvenire attraverso filtri di massa (quadrupoli), facendo viaggiare gli ioni in un tubo di volo (TOF), o confinandoli in trappole ioniche (IT, FTICR). Analizzatore Gli ioni vengono inviati dall’analizzatore al detector, che amplifica la corrente ionica diversi ordini di grandezza, generando impulsi che compongono lo spettro di massa finale. Rivelatore Bio-MS lezione 2

Esempio di rivelatore: moltiplicatore di elettroni Serie di dinodi Uno ione dall’analizzatore 106 elettroni L’urto di un singolo ione proveniente dall’analizzatore causa una cascata di elettroni. L’impulso elettrico viene successivamente digitalizzato Bio-MS lezione 2

Analizzatori: tipologie Tempo di volo (TOF) Quadrupolo (Q, triplo quadrupolo TQ) Trappola ionica (IT, trappola lineare LT) Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR) Orpitrap Bio-MS lezione 2

Assenza di campo elettrico Analizzatore a tempo di volo Ek= ½ mv2 Ionizzazione + + Eel=ezU + Campione Pusher, 10-20 kV Rivelatore Campo elettrico Assenza di campo elettrico Bio-MS lezione 2

Analizzatore a tempo di volo In un analizzatore a tempo di volo (TOF), gli ioni vengono separati all’interno di uno spazio di 1-2 metri compreso tra la sorgente di ionizzazione ed il rivelatore, detto tubo di volo. Ioni aventi una massa elevata viaggiano nel tubo di volo con velocita’ ridotta, arrivando con ritardo al rivelatore rispetto a ioni piu’ piccoli. Bio-MS lezione 2

Spettrometria di massa: caratteristiche Accuratezza Risoluzione Mass range Capacita’ di effettuare MS/MS Velocita’ di scansione Bio-MS lezione 2

Accuratezza Indica quanto il valore di massa calcolato dallo spettrometro si avvicina al valore vero. L’accuratezza si esprime in % o in ppm. 20 900 [M+H]+ = 20,900 Mr (exp) = 20,899 Intensita’ Mr (teor) = 20,892 accuratezza = 0.03% (o 300 ppm) 20 000 20 500 21 000 21 500 22 000 m/z Bio-MS lezione 2

Accuratezza e precisione . . . . . . . . . Misura precisa ma poco accurata . . . . Misura poco precisa e poco accurata . . . Centro del bersaglio: valore vero Misura poco precisa ma accurata . . . . . . . . . . . . . . . . Misura precisa ed accurata Bio-MS lezione 2

Risoluzione Intensita’ FWHM m/z m/z R = = 418 m/z 20,900 m/z = 50 20 000 20 500 21 000 21 500 22 000 m/z Bio-MS lezione 2

Quadrupolo Al rivelatore Dalla sorgente + (U + (Vcos ωt)) Bio-MS lezione 2

Quadrupolo A dati potenziali U e V solo ioni ad un preciso m/z attraverseranno il filtro a quadrupolo m/z 100 Dalla sorgente m/z 500 Dalla sorgente Al rivelatore m/z 1500 Dalla sorgente Bio-MS lezione 2

Quadrupolo Tempo di scansione = 1 sec. U/V = costante U Tempo Intensita’ m/z 100 1000 Bio-MS lezione 2

Quadrupolo E’ l’analizzatore di massa piu’ comune. (molto utilizzato in strumenti da banco GC-MS relativamente economici). Separa gli ioni nello spazio a seconda del loro rapporto m/z. Usando il voltaggio appropriato, e’ possibile fare si’ che solo ioni con un determinato m/z attraversino il quadrupolo e raggiungano il rivelatore. Il quadrupolo può essere usato come filtro ionico: possiamo settare i potenziali in modo da fare passare solo ioni aventi un determinato m/z ad un secondo analizzatore di massa o ad una camera di collisione (vedi MS/MS) Bio-MS lezione 2

Spettrometro MALDI-TOF Ionizzazione MALDI Rivelatore TOF Laser Segnale amplificato Piastra metallica Intensita’ Bio-MS lezione 2 Tempo (m/z)

ESI-QqTOF analizzatore ibrido pusher rivelatore ESI Quadrupolo Quadrupolo m/z Intensita’ 100 1000 Bio-MS lezione 2

Spettrometria di massa in tandem La ionizzazione per EI produce frammentazione degli ioni molecolari. Tali frammenti sono essenziali per ricavare informazioni strutturali sulle molecole analizzate. Al contrario, le tecniche di ionizzazione soft (MALDI, ESI, APCI) non producono frammentazione molecolare. Per ottenere informazioni strutturali sulle biomolecole ionizzate, risulta quindi necessario effettuare MS/MS (spettrometria di massa in tandem). Bio-MS lezione 2

Spettrometria di massa in tandem (MS/MS) La spettrometria di massa in tandem consiste nell’effettuare una doppia analisi di massa su un determinato campione. Per fare cio’, e’ possibile utilizzare due analizzatori in serie, o utilizzare lo stesso analizzatore a tempi diversi. MS1: spettro MS da 0 a 1000 m/z MS2: MS/MS su m/z 850.1 Selezione del picco 100 100 650.4 198.6 678.8 850.1 Intensita’ Intensita’ 466.7 401.3 80.4 850.1 1000 1000 m/z m/z Bio-MS lezione 2

Q1: Camera di collisione MS/MS su QqTOF pusher Rivelatore Da ESI Q1: Camera di collisione Q0: selezione 100 Relative intensity (%) Full scan MS m/z 1000 100 Relative intensity (%) MS/MS su m/z 1000 Bio-MS lezione 2

MS/MS su triplo quadrupolo (QQQ) frammentazione frammenti Permette esperimenti di MS/MS. In modalita’ SRM (selected reaction monitoring) fornisce sensibilita’ elevatissime. SRM = uno ione di interesse viene selezionato in continuo in Q1 (il filtro lascia sempre passare solo quello specifico ione), frammentato in Q2, ed uno o piu’ frammenti specifici vengono filtrati da Q3 e mandati al detector. Bio-MS lezione 2