Isolamento di ceppi resistenti di Salmonella con fenotipo ESBL in allevamenti di polli da ingrasso Staffolani Monica 1, Valli M. Beatrice 1, Striano Gianluca 1, Franco Alessia 2, Lovari Sarah 2 e Fisichella S 1. 1 Istituto Zooprofilattico Umbria Marche-Centro di Riferimento Regioanle per gli Enteropatogeni-Macerata 2 Istituto Zooprofilattico Lazio Toscana-Centro Nazionale di referenza per l’ Antibiotico Resistenza-Roma III Workshop nazionale di epidemiologia veterinaria – Abano Terme, settembre 2007 MATERIALI E METODI Nell’ambito dell’attività istituzionale del Centro di Riferimento Regionale di Macerata, in applicazione del sistema di sorveglianza per gli Enteropatogeni Enter- Vet, nel periodo tra il 2002 e il 2006 sono stati tipizzati sierologicamente e caratterizzati per il profilo di antibioticoresistenza circa 720 ceppi di Salmonella di origine animale, ambientale o alimentare. Per la determinazione del sierotipo è stata seguita l’ultima edizione dello schema di Kauffman White mediante l’utilizzo di sieri del commercio (Biogenetics) Per la determinazione del sierotipo con formula antigenica 4,5,12:i:- è stato impiegato un saggio di PCR messo a punto sulla base di un lavoro pubblicato da autori spagnoli Il pannello di antibiotici (Oxoid) impiegato è composto da 16 molecole come riportato nella tabella 1. La valutazione della sensibilità agli antibiotici (test di screening e conferma fenotipica) è stata ottenuta mediante diffusione in agar secondo le raccomandazioni del Clinical and Laboratory Standard Institute CLSI (ex NCCLS), Tutti gli isolati di Salmonella che abbiano dato un esito resistente o intermedio alle cefalosporine sono stati inviati al Centro di Referenza Nazionale per l’Antibioticoresistenza (CRAB) dove sono stati confermati i test di sensibilià agli antibiotici mediante metodo della Minima Concentrazione inibente. Tutti i ceppi che hanno dato esito resistente o intermedio alla MIC sono stati sottoposto al test di Conferma Fenotipico per ESBL così come indicato nel Documento CLSI (ex- NCCLS) M31-A2. Gli isolati risultati positivi per il test di conferma sono stati poi analizzati tramite PCR per la presenza dei geni bla SHV, bla TEM, bla CTX-M, bla Oxa1, bla AmpC. BIBLIOGRAFIA a. Popoff MY Antigenic formulas of Salmonella serovarS. WHO collaboratine Centre for Reference Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris b. CLSI (ex NCCLS) Documents M-31 A2 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard c. Echeita MA and Usera MA. Rapid identification of Salmonella ssp. phase 2 antigens of the H1 antigenic complex using “multiplex PCR” Res Microbiol 149: ). d. Bradford PA Extended-spectrum-beta-lactamases in the 21 st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev 14: e.Carattoli A., Lovari S., Franco A., Cordaro G., Di Matteo P., and Battisti A Extended –spectrum  -Lactamases in Escherichia coli Isolated from Dogs and Cats in Rome, Italy, from 2001 to Antimicrob Agents Chemother 49: f. Colom K., Perez J., Alonso R., Fernandez-Aranguiz A., Lariňo E., Cisterna R Simple and reliable multiplex PCR assay for detection of bla TEM and bla OXA-1 genes in Enterobacteriaceae. FEMS Microb. Lett. 223: g. Philippon A, Arlet G, Jacobi GA Plasmid-determined AmpC-type  -lactamases. Antimicrob Agents Chemother 46:1-11 h. Winokur PL, Vonstein DL, Hoffman LJ, Uhlenhopp EK, Doern GV Evidence for transfer of CMY-2 AmpC beta-lactamase plasmids between Escherichia coli and Salmonella isolates from food animals RISULTATI Dei 9 ceppi di Salmonella resistenti o intermedi alle cefalopsorine ed inviati al CRAB, 6 sono risultati caratterizzati dal fenotipo di resistenza ESBL, cinque appartenenti al sierotipo S. Livingstone ed uno al sierotipo Salmonella 4,5,12:i:- (tabella 2). Gli isolati di S. Livingstone sono risultati positivi per il gene bla SHV, mentre l’isolato di Salmonella 4,5,12:i:- è risultato positivo per il gene bla TEM e per la classe di determinanti di resistenza bla AmpC, in particolare bla CMY-2. I ceppi di S. Livingstone appartengono probabilmente allo stesso cluster e sono stati isolati nel mese di febbraio 2005 in seguito agli accertamenti diagnostici volti ad indagare le cause di un calo dell’indice di conversione in un allevamento avicolo della provincia di Macerata, attribuito poi all’infezione concomitante da S. Enteritidis. Tutti i ceppi hanno mostrato resistenza in vitro a 6 antibiotici (Ampicillina, Streptomicina, Sulfonamidi, Acido Nalidixico, Gentamicina e Cefotaxime). Il ceppo di Salmonella 4,5,12:i:-, è stato isolato nel settembre 2006 nel corso dello studio sulla prevalenza di Salmonella spp. in allevamenti di broiler (Reg CE n° 2160/2003) dai campioni di sovrascarpe prelevati presso un allevamento della provincia di Macerata ed è risultato resistente a 7 antibiotici (Ampicillina, Streptomicina, Sulfonamidi, Tetraciclina, Amoxicillina-Acido Clavulanico, Cefotaxime, Ceftazidime). CONCLUSIONI I risultati di questo lavoro sottolineano l’importanza dei test di sensibilità di primo livello come strumento di screening primario per le resistenze antibiotiche correlate al fenotipo ESBL. Inoltre si vuole mettere in evidenza la necessità di aumentare l’attenzione in merito all’esito dei test di sensibilità. Infatti per alcuni antibiotici appartenenti alle Cefalosporine di terza generazione, anche esiti intermedi dovrebbero indurre ad un approfondimento diagnostico in quanto possibili segnali di presenza del fenotipo ESBL. Il presente studio conferma l’importanza del ruolo svolto dai laboratori di primo e secondo livello della rete degli II.ZZ.SS, strumenti essenziali per fornire sensibilità e specificità adeguata al Sistema di Sorveglianza delle antibioticoresistenze nel settore veterinario, che è parte integrante della Sorveglianza che opera a favore delle azioni di Sanità Pubblica. INTRODUZIONE L’Antibioticoresistenza è l'emergenza e la propagazione di fattori di resistenza batterica agli antibiotici ed riconosce tra le cause la pressione selettiva esercitata sulle popolazioni microbiche dall'uso di questi farmaci. Negli ultimi decenni, a fronte di un utilizzo estensivo degli antibiotici in medicina veterinaria, anche con molecole di classe o struttura analoghe a quelle usate in medicina umana, si è assistito all’emergenza di fenomeni di antibioticoresistenza in batteri patogeni animali, commensali ed agenti di zoonosi. Attualmente, tra le classi di determinanti di resistenza di maggior impatto in Sanità Pubblica Veterinaria vi sono le beta-lattamasi a spettro esteso (extended- spectum beta lactamases, ESBLs) La rilevanza di tale classe di determinanti è data dal fatto che le beta lattamasi a spettro esteso inattivano alcune molecole antibiotiche (e. g. cefalosporine di terza generazione) di elezione nella terapia umana delle infezioni invasive e setticemiche di agenti zoonosici come Salmonella spp. oppure opportunisti. In ambito veterinario, tra i ceppi di Salmonella spp., il rinvenimento del fenotipo ESBL non è frequente e la resistenza alle cefalosporine di terza generazione risulta estremamente bassa sia a livello nazionale che europeo. siglaantibioticoconcentrazione NAAcido nalidixico30 mcg AMAmpicillina10 mcg CTXCefotaxime30 mcg CIPCiprofloxacina5 mcg CCloramfenicolo30 mcg GMGentamicina10 mcg KKanamicina30 mcg SStreptomicina10 mcg S3Sulfonamide300 mcg TeTetraciclina30 mcg ENREnrofloxacina5 mcg AMCAmoxicillina + Acido Clavulanico20 / 10 mcg KFCefalotina30 mcg CAZCeftazidime30 mcg CLColistina10 mcg SXTTrimetoprim + Sulfametossazolo1.25 / mcg Tabella 1 n° ceppo sierotipoannomatrice specie animale esito CTX diffusione in agar esito CTX MIC geni ESBL 1Thompson 2005 fegatopolloISnon eseguito 2Livingstone 2005 tampone ambientale polloRIbla SHV 3Livingstone 2005 tampone ambientale polloRIbla SHV 4Livingstone 2005 tampone ambientale polloRIbla SHV 5Livingstone 2005 tampone ambientale polloRIbla SHV 6Livingstone 2005 tampone ambientale polloISnon eseguito 7Typhimurium 2005 fegatopolloISnon eseguito 8Livingstone 2005 carne frescapolloIIbla SHV 94,5,12:i: fecipolloRRbla TEM Tabella 2