MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM)

Coltura batterica al TEM

Fonte di elettroni condensatore Apertura Lente obiettivo Campione Lente proiettore Binoculare Schermo fluorescente

S E M T E M Elettroni trasmessi Elettroni secondari Fascio di elettroni primari S E M Elettroni secondari T E M Scattering elastico Scattering anelastico Elettroni trasmessi

T E M e- con scattering anelastico e- con scattering elastico

Scattering anelastico Scattering elastico TEM convenzionale

Elettroni incidenti

Preparazione dei campioni per TEM FISSAZIONE FISSAZIONE CHIMICA con impiego di fissativi come GLUTARALDEIDE e PARAFORMALDEIDE (per stabilizzare le proteine) e post-fissativi come OSMIO (1%) per la fissazione di lipidi. I fissativi sono usati a concentrazioni 3-5% e sciolti in tamponi b) CRIOFISSAZIONE, congelamento rapido per immersione del campione in azoto liquido (-190°C), in genere si usano anche composti crioprotettivi per evitare danni del campione N.B: osmio e glutaraldeide vanno maneggiati con dispositivi di sicurezza secondo il D.L. 626

DISIDRATAZIONE Procedimento che porta alla totale rimozione dell’acqua nel campione e alla sostituzione con un solvente (etanolo) Passaggi in etanolo 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%

INCLUSIONE IN RESINA Le resine sono sostanze che polimerizzano in opportune condizioni e una volta che sono entrate nel campione induriscono il campione e lo rendono sezionabile. Le resine usate per la microscopia convenzionale sono EPOSSIDICHE (costituite da miscele di aldeidi) e polimerizzano a 60° Il campione viene immerso in un solvente intermedio che si miscela sia con L’etanolo sia con la resina (OSSIDO DI PROPILENE) Passaggi: ossido di propilene-etanolo, ossido di propilene assoluto, Ossido di propilene:resine (3:1) per 1h, 1:1per 1h, 1:3 per 2h Resina assoluta per 2h Polimerizzazione in stufa a 60° per 3 giorni

SEZIONAMENTO I campioni induriti vengono tagliati mediante ULTRAMICROTOMO in sezioni ultrasottili (40-80 nm) e depositati su retini (anelli con griglie di Oro, nichel, rame retino

CONTRASTAMENTO Con metalli pesanti come uranio e piombo si aumenta lo scattering elastico di membrane e inclusi nelle cellule I retini su cui sono state deposte le sezioni vengono immerse prima in acetato di uranile, lavati e successivamente in citrato di piombo

COLORAZIONE NEGATIVA